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转移蛋白酶抑制剂基因RNAi表达载体转化大豆的遗传变异及效应探究

一、引言

1.1研究背景与目的

1.1.1大豆的重要性

大豆（Glycinemax(L.)Merr.）作为全球重要的粮食作物和经济作物，在人类生活和农业生产中占据着举足轻重的地位。从粮食角度来看，大豆富含优质蛋白质，是人类膳食中植物蛋白的重要来源，对于一些地区和人群，大豆及其制品是日常饮食中不可或缺的部分，丰富了人们的膳食结构。在油料领域，大豆油是世界上最主要的食用油之一，其产量大、价格相对较为稳定，广泛应用于家庭烹饪和食品加工行业。在饲料方面，大豆粕因其蛋白质含量高，氨基酸组成合理，成为禽畜养殖中优质的蛋白质饲料原料，对畜牧业的发展起着关键作用。全球主要的大豆生产国包括美国、巴西和阿根廷，而中国是全球最大的大豆进口国，大豆的产量和贸易情况对全球经济和粮食安全有着深远影响。

1.1.2大豆虫害问题

大豆在生长过程中面临着多种虫害的威胁，严重影响其产量和质量。据统计，病虫害所造成的大豆产量损失一般为15%-30%，严重时甚至会绝收。中国大豆生产中的已知害虫种类已逾400种，其中如蚜虫、大豆食心虫、红蜘蛛等10余种害虫对大豆产量影响显著。大豆食心虫（LeguminivoraglycinivorellaMatsumura）俗称大豆蛀荚虫、小红虫，隶属昆虫纲鳞翅目、小卷蛾科，食性单一，是造成大豆减产、降低商品性的主要害虫之一，其幼虫进入豆荚蛀食豆粒，一般一个豆荚有一头虫，一头虫可食1-2个豆粒，3龄幼虫取食后呈沟道状，食至豆粒成沟、残缺，甚至食尽，荚内充满虫粪。

传统的大豆虫害防治方法主要包括农业防治、生物防治和化学防治。农业防治如适时播种、品种选择、远距离轮作等，虽能在一定程度上减轻虫害，但效果有限且受多种因素制约；生物防治利用害虫天敌如释放赤眼蜂、白僵菌寄生等方式，存在作用缓慢、受环境影响大等问题；化学防治使用杀虫剂如毒死蜱、马拉硫磷、溴氰菊酯等，虽能快速有效地控制害虫，但长期大量使用会导致害虫产生抗药性，破坏生态平衡，还会造成农药残留，危害人类健康。因此，开发新的虫害防治技术迫在眉睫，转基因抗虫技术应运而生，为解决大豆虫害问题提供了新的途径。

1.1.3研究目的

本研究旨在探究转移蛋白酶抑制剂基因RNAi表达载体转化大豆后的遗传变异情况，明确转基因大豆在基因水平上的变化规律，为其安全性评价和遗传稳定性研究提供理论依据。同时，深入分析转基因大豆的抗虫效果，评估蛋白酶抑制剂基因RNAi表达载体在大豆抗虫育种中的应用潜力，为培育高效抗虫的大豆新品种奠定基础，以提高大豆产量和质量，减少虫害损失，降低农药使用量，促进农业可持续发展。

1.2国内外研究现状

1.2.1蛋白酶抑制剂基因研究进展

植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个研究较多的抗虫基因资源，广泛存在于豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物中。目前发现的植物蛋白酶抑制剂主要有丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂三类，其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻，在植物中至少已经发现有6个家族，弧豆胰蛋白酶抑制剂、马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的抗虫效果较为理想。

蛋白酶抑制剂的杀虫机理在于它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物（EI），阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用，使昆虫无法正常消化外来蛋白。同时，蛋白酶抑制剂和消化酶形成的EI复合物能刺激消化酶的过量分泌，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应。由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程，导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸，最终造成昆虫的非正常发育或死亡。国内外有关抗虫的植物蛋白酶抑制剂基因的获得大多通过两种途径，一种是从植物不同部位的组织或细胞中提取抗虫活性蛋白，分析其活性核苷酸序列，继而克隆和转化到寄主细胞，进行筛选和选育抗虫树种；另一种是通过基因合成等分子生物学技术直接获得目的基因。

1.2.2RNAi技术在植物遗传转化中的应用

RNAi即RNA干涉（或RNA干扰），是指双链RNA导入细胞后被切割成21-23个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNA结合并导致其降解，从而使得内源基因不能表达，导致内源基因的沉默。自1998年Fire等首次在线虫中发现并阐明以来，RNAi已在其它动物、植物和真菌中被证实，参与该过程的许多基因具有高度的保守性，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱导DNA突变的一种共有的古老生理机制。

在植物功能基因组学研究中，RNAi技术为研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段。例如，在拟南芥和水稻等基因组测序完成后，利用RNAi技术可以快速验证基因功能，