实验九动物组织中DNA的提取与鉴定.pptVIP

实验九动物组织中DNA的提取与鉴定一、实验目的掌握DNA的提取方法。二、实验原理DNA+RNAPrPr+DNPRNPDNP在1mol/LNaCl中溶解度最大RNP在0.15mol/LNaCl中溶解度最大可分离DNP和RNP二苯胺二苯胺法鉴定DNA酸解脱氧核糖嘌呤ω-羟基-γ酮基戊醛蓝色的化合物SDSDNAPrDNP氯仿-异戊醇除去蛋白质95%的乙醇沉淀

几个试剂的作用柠檬酸盐、EDTA防止DNA酶对DNA的降解（可螯合除去DNA酶活性所需的Mg2+，抑制DNA酶的活性）SDS氯仿-异戊醇除去变性蛋白质使蛋白质变性

三、操作

1、制备匀浆：称取新鲜动物肝脏5g，置于研钵中，剪碎，加2倍组织重的冷0.15mol/L?NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液(10mL)，研磨成浆状，得匀浆液。（一）DNA的提取

2、抽提DNP粗制品将匀浆液（除去组织碎片）转移至离心管中，4000r/min离心10min，弃去上清夜，收集沉淀(内含DNP)。向沉淀中加两倍体积(10mL)的冷0.15mol/L?NaCl–0.015?mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，如前离心，重复洗涤2~3次。所得沉淀为DNP粗制品，移至烧杯中。?

3、DNA与蛋白质分离向沉淀中加入冷0.15?mol/LNaCl-0.1?mol/L??EDTA-Na2溶液，使总体积达到8mL，在缓慢搅拌的同时滴加5%SDS溶液2mL，使SDS最终浓度达1%，边加边搅拌，使DNA与蛋白质分离。再加入5mol/LNaCl溶液2.5mL，使NaCl最终浓度达1mol/L，搅拌10min（速度要慢），溶液变得黏稠并略带透明。

4、除蛋白质、糖等杂质?最后加入等体积的冷氯仿-异戊醇混合液，搅拌20min，4000r/min离心10min，分层情况：上层为水相（含DNA钠盐），中层为变性的蛋白质沉淀，下层为氯仿-异戊醇混合液。用吸管小心地吸取上层水相，弃去沉淀，再在相同条件下重复抽提2~3次。上清液（含DNA钠盐）用于做以下实验。

5、?沉淀DNA取上清液5mL放入干燥的试管（小烧杯）中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加入时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在试管（烧杯）内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠丝状物质，并能逐步缠绕于玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。

四、结果（二）DNA的鉴定用二苯胺法鉴定DNA。取上清液2mL于试管中，加入二苯胺试剂5mL，60－80℃加热15min，另外做一个空白对照：取2mL水于试管中，加入二苯胺试剂5mL，60－80℃加热15min，观察颜色。

（1）研钵（2）离心机（3）离心管（4）手术剪（5）吸管（6）烧杯（7）玻棒（8）试管（9）滴管（10）新鲜动物肝脏试剂和器材2.器材