扫描电镜样品制备.pptVIP

实验十一扫描电镜样品制备;扫描电镜即扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌、割裂面结构、管腔内表面的结构等。;一、扫描电镜工作原理：

主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。

主要优点：

景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。;三、扫描电镜样品的制备;取样：

将取下的动植物组织放入预冷的含有2％戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长4mm左右、高3mm左右的小块。

2.样品的清洁：

把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个拨入盛有0.1mol/LPH7.2磷酸缓冲液的青霉素小瓶中漂洗，并反复更换用于清洗的缓冲液，一般漂洗1小时，换液3-4次。;3.样品的固定

样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有不同之处。

一般在4℃的条件下完成固定比较好，戊二醛、锇酸均可单独固定，也可用“戊二醛-锇酸”双重固定法。

固定1-3小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定液，加入0.1mol/LPH7.2磷酸缓冲液，漂洗1小时，换液3-4次。

;4.脱水

从小瓶中吸出缓冲液，加入乙醇逐级梯度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为30%－50%－70%－80%－90%－100%乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停留15-30分钟。

5.置换乙醇

吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。

6.样品的干燥

常规临界点干燥法。

;加温置换：将温度调节设定在20℃处经15～20min后，由于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧化碳充分置换。

气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35～40℃)，此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经5min后，???可排气。

排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。

;7.粘贴样品

用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品底面。用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶上。粘贴后，待导电胶干透，才能进行真空镀膜和SEM镜检。

8.样品的导电处理

生物样品和其他非金属样品的表面电阻率很高，在电镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是由低原子序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的发射率很低，信号弱，难以获得必要的图像反差。因此，为了消除或减少以上不良现象的产生，生物样品和非导电的样品在扫描电镜观察前，均需进行表面导电处理。扫描电镀样品的表面导电处理方法，主要有金属镀膜法和组织导电处理法两种。其中金属镀膜法又有真空镀膜及离子溅射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀膜法进行镀膜。

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离子溅射镀膜法操作注意事项：

样品要充分干燥，否则，金属颗粒不但不能附着，反而会引起样品损伤，特别是能放出有机气体的样品，有机气体会因放电而分解，使样品引起碳化污染。

加高压时辉光放电的颜色应为蓝色或紫蓝色，若是红色，应立即停止加高压，继续抽气。

加高压后，若真空度下降幅度较大，应立即停止镀膜，待充分抽气后再继续镀膜。

;一些电镜图片