二讲正常和肿瘤组织细胞的培养.pptVIP

第二讲正常和肿瘤组织细胞的培养;优选第二讲正常和肿瘤组织细胞的培养;不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。;上皮细胞的体外培养;上皮细胞的基本特征：;体外培养的上皮组织细胞的生长生物学;2.体外培养上皮组织的生长与增殖特征;根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、

呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，

组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。

要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作

步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。

培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及

培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。;皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的

贴壁依赖性细胞。

在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基

质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮

细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞

极性表现更为明显。;(2)透射电镜检查：

②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；

1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。

阐明一般生物学性状。

刮除法

正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。

细胞核型分析：检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。

培养液：10%FCSRPMI1640

肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：

本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。

③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的LifeSpan，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；

异体动物接种：向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。

抗角蛋白抗体染色（+）

用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞

W-P小体;去除成纤维细胞

上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。??材分离细胞时

会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮

细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能

力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，

从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的

“细胞污染源”。

因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程

中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细

胞的生长。;(2)体外培养上皮细胞的形态学变化;体外培养上皮组织细胞的观察与检测;2.组织化学与免疫组织化学观察与检测

酶类：

碱性磷酸酶

琥珀酸脱氢酶

特异性抗原标记物：

角蛋白、上皮细胞膜抗原

VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白;血管内皮细胞的体外培养;人脐静脉内皮细胞的培养;2.培养方法：

;1).?将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）

2).?用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的

PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3).?用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4).?消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。

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(1)关于接种材料的制备

取材与消化

消化酶、浓度、时间

(2)排除成纤维细胞

传代去除法

加肝素培养法(90u/ml)

刮除法

(3)关于培养液

(4)关于传代培养

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(1)光镜检查

(2)透射电镜检查：

W-P小体

(3)VIII因子相关抗原的免疫组化检测;肾小管上皮细胞的培养;1.主要材料：

a.细胞来源：

b.无血清培养液：

基础培养液：