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乳酸脱氢酶实验操作规范标准

1.目的

本规范旨在建立一套标准化的乳酸脱氢酶（LactateDehydrogenase,LDH）实验操作流程，确保实验结果的准确性、可靠性和重复性，为临床诊断、科研实验等相关领域提供统一的技术指导。

2.原理

乳酸脱氢酶是一种广泛存在于生物体内的糖酵解关键酶，能催化乳酸和丙酮酸之间的可逆转化，同时伴随着辅酶NADH和NAD+的相互转换。在特定条件下，LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，辅酶NAD+被还原为NADH。NADH在340nm处有特征性吸收峰，而NAD+则无。通过监测340nm处吸光度的变化速率（升高或降低，取决于反应方向），可计算出LDH的活性。常用的方法有正向反应（乳酸→丙酮酸，340nm吸光度升高）和逆向反应（丙酮酸→乳酸，340nm吸光度降低），本规范以正向反应为例进行说明。

3.试剂与仪器

3.1主要试剂

3.1.1磷酸缓冲液（PBS）：如0.1mol/L，pH7.3-7.4（根据具体实验需求调整，应确保缓冲能力和pH稳定性）。

3.1.2乳酸钠（或乳酸锂）溶液：作为底物，浓度通常在____mmol/L，用缓冲液溶解配制。

3.1.3烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）溶液：作为辅酶，浓度通常在2-5mmol/L，用缓冲液溶解，需新鲜配制或按照说明书要求储存。

3.1.4LDH标准品（可选）：用于校准和验证实验体系。

3.1.5样本：血清、血浆、组织匀浆、细胞培养液上清等，需按照相应样本采集和处理规范进行。

3.2仪器

3.2.1分光光度计：具备340nm波长，可进行动力学扫描或定时读数，最好带有恒温比色杯槽（37℃或25℃，根据实验设定）。

3.2.2恒温水浴箱：用于试剂和样本的预保温。

3.2.3微量移液器：不同量程，确保准确移液。

3.2.4离心管、试管、容量瓶、烧杯等玻璃或塑料器皿。

3.2.5漩涡混匀器。

3.2.6冰箱：用于试剂和样本的低温储存。

4.操作步骤

4.1试剂准备

4.1.1所有试剂在使用前应置于室温或37℃水浴中平衡至实验温度（通常为37℃，具体参照试剂说明书或实验方案）。

4.1.2按照试剂说明书或实验设计，将缓冲液、乳酸钠溶液、NAD+溶液按一定比例混合，配制成工作液。注意NAD+的溶解和加入顺序，确保充分溶解。

4.2样本处理

4.2.1血清/血浆样本：采集后应尽快离心分离，避免溶血（红细胞中LDH活性极高，轻微溶血即会严重干扰结果）。若不能立即测定，应分装后于-20℃或更低温度冻存，避免反复冻融。测定前取出，室温解冻，轻轻混匀，如有沉淀需再次离心去除。

4.2.2组织匀浆/细胞样本：按照标准方法制备匀浆或提取上清，确保细胞膜充分破碎，同时避免蛋白酶对LDH的降解。

4.3反应体系配制（以分光光度计微量比色杯为例）

4.3.1取洁净比色杯，依次加入：

*磷酸缓冲液（或工作液中已含部分缓冲液，需精确计算）：XμL

*乳酸钠溶液：YμL

*NAD+溶液：ZμL

*混匀，置于分光光度计恒温槽中保温数分钟（如5分钟），使反应体系达到预设温度。

4.3.2加入样本：AμL（通常为10-50μL，根据预期酶活性调整，以确保吸光度变化在仪器线性范围内）。

4.3.3迅速混匀（可用漩涡混匀器或小心倾倒混匀，避免气泡产生），立即放入分光光度计样品室。

4.4反应启动与监测

4.4.1选择动力学模式（Kinetic），设定波长为340nm，温度为37℃（或实验设定温度），监测时间通常为3-5分钟，读数间隔为15-30秒。

4.4.2启动监测程序，记录不同时间点的吸光度值（A340）。

4.5空白校正（重要）

4.5.1试剂空白：以等量的缓冲液或生理盐水替代样本，按照上述4.3和4.4步骤操作，监测非酶促反应引起的吸光度变化。

4.5.2样本空白（可选）：若样本本身在340nm处有较强吸光度或存在干扰物质，可考虑用不含底物或不含NAD+的反应体系作为样本空白。

5.结果计算

5.1计算平均每分钟吸光度变化值（ΔA/min）：选取反应线性期（通常为初始阶段的1-3分钟内，剔除延迟期和底物耗尽期）的吸光度数据，进行线性回归，其斜率即为ΔA/min（ΔA340nm/min）。需扣除相应空白的ΔA/min。

5.2LDH活性单位（U/L）计算公式：

U/L=(ΔA/min×V总×1000)/(ε×d×V样本)

其中：

*V总：反应体系总体积（μL）

*ε：NADH在340nm处的摩尔消光系数，通常为6220L/(mol·cm)

*d：比色杯光径（cm，通常为1cm）

*V样本：加入样本体积（μL）

*1000：将μmol转换为mmol的系数（若ΔA为正值，代表N