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（正式版）DB65∕T《LAMB1基因rs159769941SNP位点辅助评定细毛羊羊毛自然长度的分子检测技术规程》
1范围
本标准规定了利用LAMB1基因rs159769941SNP位点辅助评定细毛羊羊毛自然长度的分子检测技术的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤、结果判定及检测记录与报告等内容。
本标准适用于细毛羊LAMB1基因rs159769941SNP位点的分子检测及羊毛自然长度的辅助评定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T1195动物组织基因组DNA提取与检测方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1细毛羊
以生产同质细毛为主要方向的绵羊品种，其羊毛纤维直径在18.5μm25μm之间。
3.2羊毛自然长度
细毛羊在正常饲养管理条件下，羊毛从皮肤表面自然生长的长度，通常在剪毛前测量。
3.3SNP位点
单核苷酸多态性位点，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
3.4LAMB1基因rs159769941SNP位点
位于细毛羊LAMB1基因上的一个特定单核苷酸多态性位点，该位点的不同基因型与细毛羊羊毛自然长度存在关联。
4原理
通过采集细毛羊的血液或组织样本，提取基因组DNA，利用特异性引物对LAMB1基因rs159769941SNP位点进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序或酶切分析，确定该位点的基因型。根据已知的基因型与羊毛自然长度的关联信息，辅助评定细毛羊的羊毛自然长度。
5试剂与材料
5.1试剂
5.1.1血液基因组DNA提取试剂
应符合NY/T1195的要求，如血液基因组DNA提取试剂盒。
5.1.2PCR扩增试剂
TaqDNA聚合酶：具有热稳定性，能在高温下催化DNA合成。
dNTPs：包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是PCR反应的底物。
PCR缓冲液：提供PCR反应所需的适宜pH和离子强度。
引物：根据LAMB1基因rs159769941SNP位点两侧的序列设计特异性引物，引物序列如下：
上游引物：5’[具体序列1]3’
下游引物：5’[具体序列2]3’
5.1.3测序试剂
如BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit等，用于对PCR扩增产物进行测序。
5.1.4酶切试剂
根据LAMB1基因rs159769941SNP位点的序列特点，选择合适的限制性内切酶及相应的酶切缓冲液。
5.1.5其他试剂
琼脂糖：用于制备琼脂糖凝胶，进行PCR产物的电泳检测。
溴化乙锭（EB）或其他核酸染料：用于染色，使核酸在紫外灯下可见。
6×上样缓冲液：用于混合PCR产物，便于上样。
DNA分子量标准：用于确定PCR产物的大小。
5.2材料
一次性采血针、采血管（含抗凝剂）：用于采集细毛羊血液样本。
手术刀、镊子、离心管等：用于采集细毛羊组织样本。
移液器及吸头：不同量程的移液器及配套吸头，用于准确移取试剂和样本。
PCR管：用于PCR反应。
电泳槽、凝胶成像系统等：用于PCR产物的电泳检测和成像分析。
6仪器设备
高速离心机：用于样本的离心分离，转速可达12000r/min以上。
恒温水浴锅：用于酶切反应等恒温操作。
PCR仪：能精确控制PCR反应的温度和时间。
测序仪：如ABI3730xlDNAAnalyzer等，用于对PCR扩增产物进行测序。
电子天平：用于称量试剂和样本。
pH计：用于调节试剂的pH值。
7操作步骤
7.1样本采集
7.1.1血液样本采集
使用一次性采血针对细毛羊进行静脉采血，将血液收集到含有抗凝剂的采血管中，轻轻颠倒混匀，置于4℃保存，尽快进行DNA提取。
7.1.2组织样本采集
如果采集组织样本，可使用手术刀和镊子从细毛羊的耳部、尾部等部位采集少量组织，放入离心管中，立即置于20℃保存，待提取DNA。
7.2基因组DNA提取
按照NY/T1195的方法或使用血液基因组DNA提取试剂盒提取细毛羊基因组DNA。具体步骤如下：
7.2.1血液样本DNA提取
取适量血液样本于离心管中，加入裂解液，充分混匀，室温放置一段时间，使细胞裂解。
加入蛋白酶K，在适宜温度下孵育，使蛋白质消化。
加入有机溶剂进行抽提，去除蛋白质和其他杂质。
加入无水乙醇沉淀DN
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