慢病毒稳定转染细胞株构建方法.pdfVIP

稳转慢

一、所需试剂

1、慢载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒

-20℃保存2-3年，液-80℃保存1年）

（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光、gag5′

端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分

（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分

（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他的包膜蛋白代替了env.

三种质粒共同转染产生不具有自我能力的载体。

2、包装细胞：293T细胞

3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒

4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物

5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5XPEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl

8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌

**也可直接从公司买来液（-80℃膜冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为

8

10TU/ml

6、10mg/mlpolybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面

的阴离子结合，提高慢对细胞的效率，通常加入polybrene能提高效率2～10

倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）

7、无培养基：optimen

8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）

9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞

二、具体步骤

一包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）

第一天

1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM4-5ml，过夜

2、配制5XPEG8000/NaCl溶液

称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度30min湿热

30min；保存在4℃

第二天

1、配管

试剂加样量/μl推荐量/μl、μg合计

A管PLKO.1/pCDH3

psPAX21

206

pMD2.G2

Opti200

B管XTREME-GENE6

206

Opti200

A+B混合室温静置20min

2、加入2ml全培养基DMEM

3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基