实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.pptVIP

实验八SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质;一、目的要求;二、原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(N，N，N?，N?—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。

;凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。

表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系

分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)

蛋白质

?104 20-30

1-4×104 15-20

1-5×104-1×105 10-15

1×105 5-10

?5×105 2-5

核酸(RNA)

?104 15–20

104–105 5-10

105-2×106 2-2.6

;聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。

目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。

;图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

;图2夹心垂直板电泳槽示意图

图3凝胶模示意图

1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框

4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统;（1）样品浓缩效应

(a)凝胶孔径不连续性：

(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；

在pH6.7的凝胶缓冲体系中

前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)

尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根

mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度)

当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；

（c)电位梯度的不连续性：

(2)分子筛效应

(3)电荷效应;图5不??续系统浓缩效应示意图

;三、试剂与器材

试剂：10%SDS、凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0mol/LpH8.9Tris－HCl缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH6.7Tris－HCl缓冲液）、10%过硫酸铵、10%TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250、7%醋酸

器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床

;五、操作方法

1.安装夹心式垂直板电泳槽

(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。

(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。

(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。;;3.制备凝胶板

将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。

将上、下贮槽的蒸