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重组子的筛选方法

在分子克隆技术中，将目的基因插入载体后，需要从大量的转化子中筛选出含有正确重组DNA分子的克隆，这一过程称为重组子筛选。筛选方法的选择取决于载体类型、插入片段的特性以及实验目的，其核心是区分“空载体”与“重组载体”，并进一步验证插入片段的正确性。以下将从载体标记筛选、核酸水平筛选、蛋白质水平筛选三个层面，系统介绍常用的重组子筛选策略及其原理与应用。

一、载体标记筛选：基于载体自带的筛选标记

载体标记筛选是最基础的筛选方法，利用载体上预先设计的选择标记基因（如抗生素抗性基因、营养缺陷型互补基因）或报告基因（如β-半乳糖苷酶基因），通过宿主细胞的表型变化快速排除未转化细胞或空载体转化细胞。

1.抗生素抗性筛选：排除未转化细胞的“第一道关卡”

绝大多数克隆载体（如质粒pUC系列、pET系列）均携带抗生素抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因ampR、卡那霉素抗性基因kanR）。其原理是：只有成功导入载体的宿主细胞（含抗性基因）能在含对应抗生素的培养基上存活，而未转化细胞因缺乏抗性基因被抗生素杀死。

操作流程：将转化后的菌液涂布于含抗生素的固体培养基，37℃培养12-16小时后，培养基上长出的单菌落即为“转化子”（含载体的细胞）。

局限性：仅能筛选出“含载体的细胞”，无法区分“空载体”与“重组载体”——若载体未插入目的基因（空载体），其抗性基因仍能正常表达，因此抗性筛选后需进一步验证。

2.营养缺陷型互补筛选：针对特殊宿主的筛选策略

部分载体携带营养缺陷型互补基因，可与宿主细胞的营养缺陷突变体互补。例如，酵母表达载体常携带URA3基因（编码尿嘧啶合成关键酶），而宿主细胞为*ura3-*突变体（无法合成尿嘧啶）。

原理：只有导入载体的宿主细胞能在无尿嘧啶的培养基上生长（载体URA3基因补偿宿主的功能缺陷），未转化细胞则因无法合成尿嘧啶死亡。

应用场景：主要用于酵母、大肠杆菌等模式生物的基因克隆，尤其适用于需要在“无抗生素环境”中筛选的实验（如长期培养的细胞系）。

3.β-半乳糖苷酶蓝白斑筛选：区分空载体与重组载体的经典方法

蓝白斑筛选依赖载体上的LacZα互补系统，是区分空载体与重组载体的常用手段。其核心元件包括：

LacZα片段：载体上携带β-半乳糖苷酶（LacZ）的N端短片段（α肽）；

宿主细胞：含LacZω片段（LacZ的C端长片段，无活性）；

多克隆位点（MCS）：位于LacZα片段内部，是目的基因的插入位点；

诱导物：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），可诱导LacZ基因表达；

底物：X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），被LacZ水解后产生蓝色产物。

筛选原理：

空载体转化子：LacZα片段完整，与宿主的LacZω片段互补形成有活性的LacZ酶，水解X-gal产生蓝色菌落；

重组载体转化子：目的基因插入MCS后，LacZα片段被破坏（插入失活），无法形成有活性的LacZ酶，X-gal不被水解，形成白色菌落。

操作流程：将转化菌液涂布于含IPTG+X-gal+抗生素的培养基，培养后直接观察菌落颜色——白色菌落为候选重组子。

优势：一步筛选即可区分“空载体”与“重组载体”，无需额外操作；局限性：若插入片段过短（100bp），可能不影响LacZα的活性，导致假阳性蓝色菌落。

二、核酸水平筛选：直接验证DNA分子的正确性

载体标记筛选仅能初步判断“是否含重组载体”，但无法验证插入片段的大小、方向及序列正确性。核酸水平筛选通过直接检测重组DNA的结构，是确保克隆正确性的关键步骤。

1.酶切鉴定：最直观的“插入片段大小验证”

酶切鉴定利用限制性内切酶的特异性，通过切割重组载体后电泳分析片段大小，判断是否含有目的基因。

原理：选择“仅在载体多克隆位点（MCS）存在、且不在目的基因内部”的限制性内切酶（如EcoRⅠ、BamHⅠ），对重组载体进行单酶切或双酶切：

单酶切：若载体为环形，酶切后线性化，电泳条带大小应为“载体长度+目的基因长度”；

双酶切：用两种限制性内切酶切割（如EcoRⅠ+BamHⅠ），电泳后会出现两条带——一条为载体片段，一条为目的基因片段（大小与预期一致）。

操作流程：

挑取抗性筛选后的单菌落，接种于液体培养基培养；

提取质粒（重组载体）；

用选定的限制性内切酶酶切质粒；

琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小是否与预期一致。

优势：快速、直观，能直接验证“是否插入目的基因”及“插入片段大小是否正确”。

2.PCR鉴定：快速高效的“插入片段特异性验证”

PCR鉴定利用特异性引物扩增插入片段，是目前最常用的筛选方法之一，尤其适用于高通量筛选。

原理：设计一对引物——上游引物结合于“载体MCS上游的序列”，下游引物结合于“目的基因内部或MCS下游的序列”。若重组载体含目的基因，PCR可扩增出