第章DNA重组(限制性内切酶与DNA片段化).pptVIP

1.天然DNA的种类;天然DNA的提取;2.限制性内切酶和DNA片段化;限制性内切酶;;2.1寄主控制的限制与修饰现象;限制——修饰现象;;产生这种现象的原因何在;限制——修饰体系;;2.2分类;限制性核酸内切酶的类型;2.3命名;2.4基本特性;2.5内切酶识别序列的特征;序列长度：多数为6bp;6

NotIGCGGCCGC8

BbvCICCTCAGC7

PpuMIRGGWCCY7;结构;二重旋转对称;;5’…G-C-T-G-OHP--A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’;5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’

3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’;非对称;识别序列出现频率;稀切酶（rarecuttingenzymes）;同裂酶(isoschizomer);同尾酶（isocaudamer）;2.6切割位点;偏爱位点P42;2.7反应系统;大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：;1）DNA纯度：要求较纯

因素：

蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高浓度金属离子

措施：

增加酶的用量；扩大反应系统体积

延长反应时间；添加亚精胺;2)DNA的甲基化程度;3）DNA分子构型

效率：线性DNA分子

大于

超螺旋质粒DNA

环状病毒DNA;4）识别序列的侧面序列

限制酶切割DNA，对识别序列两侧的非识别序列有长度要求，只含识别序列的寡核苷酸是不会被酶切的，故通常要在识别序列两侧多加若干个核苷酸;试剂公司提供的包装说明书

会标明酶活性单位数和容积活性，最佳作用条件;2酶活单位;常规缓冲液

pH，Mg++，DTT/β-ME，(10X)

pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl，乙酸

离子强度：NaCl

高中低

100mM50mM0

③Mg++10mMMgCl2，MgAc;

大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃

一部分为50-65℃少数25-30℃

高温作用酶于37℃时活性多数10-50%

TaqI(65℃)10%，ApoI(50℃)50%;2.8staractivity;2、抑制staractivity的措施

①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度

②保证反应体系中无有机溶济或乙醇

③提高离子强度到100～150mM

(如果不会抑制的??)

④降低反应pH至pH7.0

⑤使用Mg++作为二价阳离子;;2.9.1单酶切法;2.9.2双酶切法;重组克隆载体pMD18-T-RIP双酶切电泳图

M:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ

1:BamHI和SacI双酶切后的重组克隆载体18-T-RIP;谢谢大家！