生物显微镜技术2-其他常用制片方法和特殊染色方法.pptVIP

第二章其他常用制片方法

和特殊染色方法;第一节其他常用制片方法;;（一）冷冻切片的种类

半导体冰冻切片机

低温恒冷箱冰冻切片法

二氧化碳冰冻切片法

甲醇循环制冷冰冻切片法等

这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。;（二）冷冻切片的制作方法

低温恒冷箱冷冻切片制作法

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

;;操作方法及步骤：

（1）取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

（2）速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立???对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。

常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。

液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。如组织块小可适量加OCT包埋剂;;;（5）冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净。

②组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

;③当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。

④用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。

;;（三）冰冻切片的优缺点：;;（四）主要应用;二、火棉胶切片;1、取材相同，在FAA液福尔马林-酒精-醋酸混合固定液中固定24小时。可在此液中保存。

2、脱水从低浓度至高浓度乙醇，每级需要1～2天，接着过渡到1/2乙醇+1/2乙醚中（至少1小时）1～2天

3、浸火棉胶浸胶时间根据材料大小和厚薄而定，5毫米厚的组织需要1～2周，大块组织需要1～2个月。

4、包埋凝固后取出放入等量的95%酒精及甘油中，可长期保存。放入18%火棉胶溶液中包埋。让酒精和乙醚慢慢挥发，一般2～3周。

5、修块、切片材料周围保留3～6毫米的火棉胶，修好好放入70%的酒精保存，有继续硬化火棉胶的作用。85%的酒精则有软化火棉胶的作用。滑动切片机切片，切片放在70%的酒精中。

6、染色染色可将带有火棉胶的切片进行染色，也可以用1/2乙醇+1/2乙醚溶去火棉胶后，再染色。;;;;三、涂片法;;;;;;四、磨片法;;;;第二节特殊染色技术;一、结缔组织染色法;?（一）胶原纤维染色法

1、VenGioeson氏苦味酸复红法（1889）

此法是用来区分胶原纤维和肌纤维的经典染色方法，习惯称之为V－G染色法。

染液是苦味酸和酸性复红的混合液

操作方法：切片脱蜡常规至水，蒸馏水洗；Weigent氏铁苏木素液染核；水洗（用自来水充分冲洗）；1％酸盐酸酒精分化；流水冲洗；VenGieson氏苦味酸复红染色1—5分钟；滤纸稍印干或用95％酒精迅速脱色与脱水；无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封盖。

结果：胶原纤维红色，肌纤维黄色，核褐色。

;;;;;;二、?肌肉组织染色法;三、神经组织染色;;;;四、单种细胞;;;;;;五、染色体染色法;;;;;;附：LTS液基薄层细胞制片方法;工作原理

■沉降分离技术

利用LTS特殊沉降液进行细胞的自然沉降。由于病变细胞核浆比增大使得比重变大，沉降速度快，能先沉降到玻片上，优先被玻片上大量的电荷层所捕获，而其他细胞和杂质沉降速度慢，利用这一特性就能有效的分离病变细胞与其他非诊断成分，提高诊断率。;■?电荷捕获技术

LTS应用了最前沿的电荷捕获技术，经过这种特殊工艺处理后的载玻片能在表面富集大量的正电荷，形成一层致密的电荷涂层，能够快速、有效地捕获沉降中带负电的细胞及微生物，形成稳固的结合。能有效防止脱片和白片，提高病变细胞的捕获能力和诊断率。

;LTS?制片系统的用