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小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定

实验目的掌握RNA操作注意事项了解鉴定RNA含量和质量的方法了解RNA抽提原理熟悉RNA抽提方法

实验原理理论基础:真核生物结构基因有内含子基因在转录水平的表达实验原理:四步骤组织或细胞匀浆分离总RNA纯化RNA检测RNA的纯度及完整性

理论基础真核生物中绝大多数基因有内含子,如直接由基因组克隆目的基因,不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段。检测基因在转录水平的表达,需检测mRNA含量,定量RT-PCR是主要方法之一。

实验原理抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质,常用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA,同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提,可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀,即可获得纯化的总RNA。

RNA产物的鉴定RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。高纯度RNA的A260/A280应处于1.6至1.8之间,A260与RNA浓度呈正比,1OD=40μg/mlRNA。RNA的完整性可通过电泳检测RNA为单链分子,二级结构复杂,需先经甲酰胺变性,再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。细胞总RNA以rRNA含量最高,电泳时可观察到18S与28SrRNA两条清晰条带,且亮度之比接近1:2,表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带,主要由5S、5.8SrRNA与tRNA组成。

RNA电泳结果示意图28S18S5S

取小鼠肝组织匀浆处死小鼠匀浆取肝50~100gTrizol1ml匀浆

RNA纯化操作步骤加入氯仿0.2ml,剧烈振荡,室温放置10分钟。12000rpm离心15min,取上清。(离心后溶液分为三相,即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相,绝不能有中层蛋白混入。)加入异丙醇0.5ml,振荡混匀,室温放置10分钟,12000rpm离心10min,弃上清。(加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。)1ml75％乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min,重复一次。空气干燥沉淀,溶解于20μlDEPC-H2O。留样2μl,其余－70℃保存备用。

分光光度法操作步骤加1μlRNA溶液于0.4mlDEPC-H2O,充分混匀,读取260nm与280nm的吸光度数值。

操作注意事项(二)DEPC是强烈的烷化剂,通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性,是消除外源性RNA酶的主要方法。但CEPC有致癌作用,并具有很强的反应性,因此注意:使用时,不直接接触DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理,使DEPC分解后使用。

操作注意事项(三)为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性,酶制剂溶于50％的甘油中,-20oC储存可保持液状。但高浓度的甘油对酶促反应有抑制作用,因此酶的用量不能超过反应体积的1/10。在进行各种酶促反应时,应首先加水,再加入其它成分,最后加酶。