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基因工程策略构建高产纳他霉素菌株及发酵条件的深度优化

一、引言

1.1纳他霉素概述

纳他霉素（Natamycin），又名游霉素、匹马霉素，是一种由链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类。其分子式为C_{33}H_{47}NO_{13}，分子量为665.725，呈近白色或奶油黄色结晶性粉末状，无臭无味，几乎不溶于水，微溶于甲醇，可溶于冰醋酸和二甲基亚砜。

纳他霉素具有独特的抗菌特性，能够专性地抑制酵母菌和霉菌的生长，同时还能有效阻止丝状真菌中黄曲霉毒素等真菌毒素的形成。其作用机制主要是与真菌细胞膜上的固醇相结合，形成多烯固醇复合物，改变细胞膜的渗透性，导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸、氨基酸等外流，从而影响真菌细胞的正常代谢，最终达到抑制其生长的目的。与其他抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，安全性高。这使得它在多个领域都具有广泛的应用价值。

在食品行业，纳他霉素作为一种高效、安全的天然生物防腐剂，被广泛应用于乳制品、肉类、饮料、水果、烘焙食品等的保鲜和防腐。在乳酪制品中，它能防止乳酪在成熟过程中发霉，限制霉菌毒素的形成，且由于其难透入乳酪，仅停留在表面，不影响乳酪的成熟过程，具体应用方法包括喷洒、浸泡以及添加到涂层中等；在广式月饼中，采用喷洒法将其悬浮液喷涂在月饼表面及底部，可有效防止月饼霉变，对于生咸蛋黄浸泡于悬浮液中也能防止蛋黄馅霉变；在面包糕点中，将其溶液喷在表面或喷洒在生面团表面，能起到理想的防霉保鲜效果且不影响口感；在肉制品中，通过浸泡或喷洒的方式使用，可有效防止香肠等表面长霉；在沙拉酱、酱油、饮料等食品中添加适量纳他霉素，能抑制微生物生长，延长产品保质期。

在医药领域，纳他霉素可用于治疗真菌感染，包括假丝酵母、曲霉菌、镰刀霉等引起的疾病，常被用作眼药水或者口腔药剂。在眼药水中，5%含量的纳他霉素适用于治疗微生物引起的真菌性睑炎、结膜炎和角膜炎，包括腐皮镰刀菌角膜炎。此外，在饲料、化妆品等行业，纳他霉素也展现出一定的应用潜力，用于防止产品受到真菌污染，保障产品质量和安全性。其在各领域的广泛应用，充分体现了纳他霉素在保障食品安全、维护人类健康以及提升产品品质等方面的重要性。

1.2纳他霉素的生产现状

目前，工业化生产纳他霉素主要依靠发酵法，主要生产菌株有恰塔努加链霉菌（Streptomyceschattanoogensis）、纳塔尔链霉菌（Streptomycesnatalensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomycesgilvosporeus）等。在传统的纯培养条件下，这些菌株发酵生产纳他霉素存在诸多问题，导致产量较低、成本较高，严重限制了纳他霉素的大规模应用和推广。

从发酵过程来看，传统发酵条件难以精准满足菌株生长和纳他霉素合成的最佳需求。在营养物质方面，培养基中碳源、氮源、磷源以及微量元素等的种类和比例，对菌株的生长代谢和纳他霉素的合成有着显著影响。若碳源和氮源的配比不合理，可能导致菌株生长缓慢或代谢途径偏向其他产物的合成，从而降低纳他霉素的产量。例如，当碳源过多而氮源不足时，菌株可能会将更多的能量用于碳源的代谢，而减少对纳他霉素合成相关物质的合成。在发酵条件的调控上，温度、pH值、溶氧等参数的波动也会对纳他霉素的产量产生负面影响。温度过高或过低都可能影响菌株体内酶的活性，进而影响代谢途径和纳他霉素的合成；pH值的不适宜会改变细胞膜的电荷性质，影响营养物质的吸收和代谢产物的排出；溶氧不足则会导致菌株生长和代谢受到抑制，因为纳他霉素的合成过程需要充足的氧气供应。

此外，传统发酵过程中，菌株自身的代谢调控机制也限制了纳他霉素的产量提升。纳他霉素的生物合成是一个复杂的代谢网络，涉及多个基因和酶的参与。在传统培养条件下，菌株自身的反馈调节机制可能会在纳他霉素达到一定浓度时，抑制相关基因的表达或酶的活性，从而限制了产量的进一步提高。而且，由于发酵过程中代谢产物的积累，可能会对菌株产生毒性，影响菌株的生长和纳他霉素的持续合成。

为了提高纳他霉素的产量，降低生产成本，研究人员进行了大量的探索和尝试。在培养基优化方面，不断尝试不同的碳源、氮源组合，如以玉米糖浆为碳源、棉籽饼为氮源、酵母提取物为有机氮源、KH_2PO_4为磷源时，可提高纳他霉素的产量；在发酵条件调控上，通过精确控制温度、pH值等参数，如将培养温度从28℃调整为32℃，pH值从6.5调整为7.0，可使纳他霉素产量提高25%左右。然而，这些传统的优化方法对纳他霉素产量的提升效果有限，难以满足日益增长的市场需求，因此，寻找新的技术和方法来提高纳他霉素产量迫在眉睫。

1.3研究目的与意义

本研究旨在通过基因工程技术构建高产纳他霉素的基因工程菌株，并对其发酵条件进行优化，以提高纳他霉素的产量，降