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金黄色葡萄球菌蛋白A的原核表达及生物亲和性研究

一、引言

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）作为一种广泛分布于自然界及人体的革兰氏阳性球菌，对人类和动物健康构成显著威胁。其致病机制复杂多样，涉及多种毒力因子，其中金黄色葡萄球菌蛋白A（StaphylococcalProteinA，SPA）是重要致病因子之一。

SPA能特异性地与人类及多种哺乳动物免疫球蛋白G（IgG）的Fc段结合，这种结合不仅干扰了IgG的正常免疫功能，使其无法有效发挥免疫防御作用，还可能引发一系列免疫相关疾病，如感染性心内膜炎、败血症等。因此，深入研究SPA的表达及生物亲和性，对于揭示金黄色葡萄球菌的致病机制、开发新型诊断方法及治疗策略具有重要的临床意义。

在原核表达系统中对SPA进行表达，能够获得大量高纯度的蛋白，为后续的功能研究和应用开发提供充足的材料。同时，探究SPA与不同来源IgG的生物亲和性，有助于了解其在不同宿主免疫反应中的作用机制，为疾病的诊断和治疗提供理论依据。

二、材料与方法

2.1材料

菌株与质粒：金黄色葡萄球菌ATCC25923株用于提取基因组DNA作为扩增SPA基因的模板。大肠杆菌Top10用于构建克隆载体，BL21（DE3）用于表达重组蛋白。原核表达载体选用pET30a（+），该载体具有高效表达、便于纯化等优点。

主要试剂：PCR相关试剂，如高保真DNA聚合酶、dNTPs、引物等；限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ；T4DNA连接酶；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；His亲和层析柱及相关洗脱缓冲液；人、小鼠、兔、猪及山羊血清用于生物亲和性分析；SDS相关试剂；Western-blot相关试剂，包括一抗、二抗、化学发光底物等。

仪器设备：PCR扩增仪、离心机、恒温摇床、电泳仪、转膜仪、化学发光成像系统等。

2.2方法

SPA基因的扩增与克隆：以金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA为模板，根据GenBank中公布的spa基因序列（NCTC8325株73429-74979bp）设计特异性引物，扩增包含E、D、A、B、C五个结合功能域及X结构域的片段，长度约为1320bp。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，连接到pMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌Top10细胞。通过菌落PCR及测序鉴定阳性克隆，获得克隆载体pMD18-T-SPA。

表达载体的构建：将pMD18-T-SPA和pET30a（+）载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶进行连接，构建重组表达载体pET30a（+）-SPA。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，通过菌落PCR及双酶切鉴定阳性转化子。

SPA重组蛋白的表达：挑取含重组载体pET30a（+）-SPA的BL21（DE3）单克隆菌落，接种于含卡那霉素（50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，按1:100的比例转接至新鲜的LB培养基中，继续培养至OD600值达到0.6-0.8。加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导表达5.5h。诱导结束后，14000g/min离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体两次，用于后续分析。

SPA重组蛋白的鉴定：采用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况。将收集的菌体用适量的SDS-PAGE上样缓冲液重悬，煮沸5min使蛋白变性，然后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液染色，观察蛋白条带。同时，采用Western-blot进一步鉴定目的蛋白。将SDS-PAGE分离的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1h，加入抗His标签的一抗（1:5000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，加入HRP标记的二抗（1:10000稀释），室温孵育1h。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，最后用化学发光底物显色，在化学发光成像系统下观察结果。

SPA重组蛋白的纯化：采用His亲和层析法纯化重组蛋白。将诱导表达后的菌体超声破碎，4℃、12000g/min离心30min，收集上清。将上清缓慢加入到预先平衡好的Hi