实验二——清球蛋白盐析吴静.pptVIP

生物化学与分子生物学实验

实验十

血清蛋白的盐析及清/球比值的测定

实验目的

（ExperimentalObjectives）

掌握盐析的原理和方法。

掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。

了解血清蛋白质定量测定的临床意义。

实验原理

(ExperimentalPrinciples)

蛋白质的胶体性质

蛋白质的呈色反应——考马斯亮兰染色法

蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。

沉淀的原因:破坏水化膜;改变蛋白质表面基团的解离.

沉淀的方法:盐析法的原理;有机溶剂法;重金属盐沉淀法;生物碱试剂和某些酸类沉淀法

正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分，约60%以上，其余为球蛋白，两者比例为1.5-2.5：1。

清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。

蛋白质的呈色反应

（1）Bradford显色法

考马斯亮蓝G250（Coomassiebrilliantblue）与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色。此时蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。此法灵敏度比酚试剂法高4倍，常用于快速定量分析。

考马斯亮蓝G-250

（2）双缩脲反应

血清蛋白质定量测定的临床意义

正常血清中含有多种蛋白质，其总量为6-8g/100ml。

在某些病理情况下

蛋白质浓度降低——如营养不良、肝脏疾患

蛋白质浓度增高——肾病综合症、严重脱水情况下

（二）血清蛋白含量测定

1.标准曲线制作

（1）蛋白标准液的倍比稀释：

管号

1

2

3

4

0.9%NaCl

200μl

200μl

200μl

标准蛋白溶液（1mg/1ml）

2#200μl

3#200μl

4#200μl

400μl

2.血清中蛋白质浓度的测定

（1）血清样品的稀释：取2支1.5mlEP管，标记1’、2’号，按下表稀释.

管号

1’

2’

0.9%NaCl

180μl

380μl

血清

20μl

1’20μl

（2）盐析上清（清蛋白）的稀释：取2支1.5mlEP管，标记1’’、2’’号，按下表稀释

管号

1’’

2’’

0.9%NaCl

180μl

180μl

血清

20μl

1’’20μl

（3）血清中蛋白质浓度的测定：取2支大试管，标记5、6号，按下表加入试剂。

管号

5

6

考马斯亮蓝G-250）

3ml

3ml

稀释血清

（2’号管）

100μl

稀释盐析上清

（2’’号管）

100μl

蛋白质含量（μg）

A595nm

取样后充分混合，放置2min后,记录A595nm，并通过标准曲线查得待测样品中蛋白质含量X（μg）。

（三）绘制标准曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白浓度及清/球比值。

血清蛋白（总蛋白）浓度=

图示值×200（稀释倍数）=（mg/ml）

盐析上清（清蛋白）浓度=

图示值×200（稀释倍数）=（mg/ml）

计算清/球比值:

清蛋白的浓度:总蛋白的浓度-清蛋白的浓度）=

思考题(Questions)

蛋白质分离纯化的方法