定制测序引物设计与应用要点.pdfVIP

定制引物设计：需要考虑的事项

本节：

•定制引物的用途

•Illumina技术和化学的回顾

•设计定制引物

•验证您的定制引物

•使用自定义引物进序

自定义引物的用途

Illumina并不推荐也不支持使用自定义引物。然而，在某些情况下，实验可以从使用自定义

引物中大大受益。如果正确设计以与Illumina的化学反应兼容，它可以用来克服某些。其中

一个用途是用于独特的构建协议，这些协议会改变Illumina引物结合的位置。

另一个更常见的自定义引物使用示例是对于具有初始恒定区域的进序。这个区域可能是生物

性质的、方法的副产品、连接子等。Illumina的平台使用一种算法，该算法根据的前四个周期定

义独特的簇。初始恒定区域可能会干扰这一过程。在过去，GenomeAnalyzer(GA)平台可以编程在

稍后几个周期定义簇以适应这种情况，但新的HiSEQ平台不具备此功能。

以下是典型的Illumina结构：

定制引物在这些样本中的作用如下所示。它允许在恒定区域开始。这不仅使样本与

HiSEQ的算法兼容，还为客户了可用数据。

CustomPrimerDesign:ThingstoConsider

Topicsinthissection:

•Usesofcustomsequencingprimers

•ReviewofIlluminatechnologyandchemistry

•Designingacustomsequencingprimer

•Validatingyourcustomsequencingprimer

•Orderingsequencingusingacustomprimer

Usesofcustomsequencingprimers

CustomsequencingprimersarenotrecommendednorsupportedbyIllumina.However,thereare

instanceswhenanexperimentcangreatlybenefitfromtheuseofacustomprimer.Ifdesigned

correctlytobecompatiblewithIlluminaschemistry,itcanbeusedtoovercomecertainobstac.

OneuseisforuniquelibraryconstructionprotocolswhichalterthesequencewhereanIllumina

primerwouldanneal.

Anothermorecommonexampleofcustomprimeruseisforsequencinglibrarieswithaninitial

constantregion.Thisregioncanbebiologicalinnature,abyproductofthemethod,alinker,etc.

IlluminastformusesanalgorithmwhichdefinesuniqueclustersbasedonthefirstFOURcyc

ofsequencing.Initialconstantregionscanobscurethisprocess.Inthepast,theGenomeAnalyzer

(GA)tformcouldbeprogrammedtodefineclustersatslightlylatercyctoaccomodatethis,but

thenewHiSEQtformdoes