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引物设计:

1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

首位20个碱基保护碱基4个

首位20个碱基

保护碱基4个

上游酶切位点

设计引物：primer-up：---------

末尾20个碱基的反向互补碱基保护碱基4个下游酶切位点Primer-down：-----------

末尾20个碱基的反向互补碱基

保护碱基4个

下游酶切位点

核对----送公司合成。

对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at4℃保存。

PCR（P出目的片段）：

（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：

1，揺菌过夜：2ul韩家淮实验室的菌液，

15ml离心管Xul相应的抗生素

15ml离心管

3mlLB94℃5min

33cycles2,pcr:菌液1ul94℃30sec

33cycles

Pcr温度体系Pcr(50ul)反应体系2xPFUmix25ul

Pcr温度体系

Pcr(50ul)反应体系

Primer1ul72℃Xmin

2dH2O23ul72℃5min

（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）

3，跑胶、回收:

（1），配胶：

煮沸3次1%的琼脂糖胶：大块称0.6g的琼脂糖

煮沸3次

1%的琼脂糖胶：大块

加入60ml的1XTAE

加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时)

25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）

4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:

按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，ElutionBuffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloadingbuffer2ul、2dH2O6ul。

酶切、链接：

1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）

insert：上述胶回收产物35ul

10xHbuffer（1.5x）7ul

50ul的体系ddH2O6ul

酶11ul

酶21ul

2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）

Vector（1ug/ul）：2ul

10xbuffer（1.5x）3ul

20ul的体系ddH2O13ul

酶11ul

酶21ul

为方便以后使用，载体可以一次性多切点。

3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。

4，连接：

2xRapidLigation6ul

Vector0.8ul

12ul的体系insert4.5ul

（目的是为了多加点insert）T4DNALignase1ul

转化：

质粒10ul感受态细菌10ul{

质粒10ul

感受态细菌10ul

⑴、冰上20分钟-→热激：42℃、90秒-→冰上2分钟

⑵、加1mlSOC（或者1mlLB），37℃、180rpm、45分钟。

⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄）。

⑷、250