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分子生物学方法在鉴别鱼糜制品原料鱼种中的应用

摘要

本文系统阐述了分子生物学方法在鉴别鱼糜制品原料鱼种中的应用，详细介绍了聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR、DNA条形码技术、环介导等温扩增技术（LAMP）等分子生物学技术的原理、优势及在鱼糜制品鱼种鉴别中的具体应用。同时，分析了当前分子生物学方法应用存在的问题，并对未来发展趋势进行了展望，旨在为鱼糜制品原料鱼种的准确鉴别提供理论与技术参考，保障鱼糜制品市场的质量与安全。

关键词

分子生物学方法；鱼糜制品；原料鱼种；鉴别

一、引言

鱼糜制品以其丰富的口感和较高的营养价值，深受消费者喜爱。常见的鱼糜制品包括鱼丸、鱼糕、蟹棒等。然而，由于不同鱼种的成本、营养价值存在差异，一些不法商家可能会在鱼糜制品中使用低价鱼种替代高价鱼种，以次充好，这不仅损害了消费者的利益，也扰乱了市场秩序。传统的鱼种鉴别方法，如形态学鉴定，在鱼糜制品加工后，因原料鱼的形态结构被破坏，难以准确鉴别。而分子生物学方法以生物体内的核酸等遗传物质为研究对象，具有准确性高、特异性强、灵敏度高等优势，能够有效解决鱼糜制品原料鱼种的鉴别难题，在鱼糜制品质量监管与市场规范中发挥着重要作用。

二、分子生物学方法在鱼糜制品原料鱼种鉴别中的具体应用

（一）聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术是一种体外扩增DNA的技术，其原理是利用DNA双链复制的原理，在引物、DNA聚合酶、dNTP等物质的作用下，通过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤的循环，实现特定DNA片段的指数级扩增。在鱼糜制品原料鱼种鉴别中，选择鱼类基因组中具有种属特异性的基因片段，如细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因、16SrRNA基因等作为靶基因，设计特异性引物。通过PCR扩增鱼糜制品中的靶基因片段，然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳条带的大小和有无，判断鱼糜制品中是否含有目标鱼种的DNA，从而实现鱼种的鉴别。例如，通过设计针对大黄鱼的特异性引物，利用PCR技术能够准确鉴别鱼糜制品中是否添加了大黄鱼。PCR技术的优势在于操作相对简便，对实验设备要求不特别苛刻，且具有较高的特异性和灵敏度，但存在操作过程中容易出现污染，导致假阳性结果，以及难以实现定量分析等局限性。

（二）实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是在PCR技术的基础上发展起来的一种能够对DNA进行定量分析的技术。该技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。在鱼糜制品原料鱼种鉴别中，实时荧光定量PCR不仅可以定性判断鱼糜制品中是否含有目标鱼种的DNA，还能够准确测定目标鱼种DNA在鱼糜制品中的含量。例如，在检测鱼糜制品中是否掺杂低价鱼种替代高价鱼种时，通过实时荧光定量PCR测定高价鱼种和低价鱼种特定基因的拷贝数，从而判断鱼糜制品中各鱼种的比例。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR具有灵敏度更高、准确性更好、能够实现定量分析、自动化程度高、污染风险相对较低等优点，但该技术对实验设备和试剂要求较高，检测成本也相对较高。

（三）DNA条形码技术

DNA条形码技术是利用生物体内一段标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的技术。在鱼类中，COI基因是最常用的DNA条形码序列。该技术的操作流程为：首先提取鱼糜制品中的总DNA，然后以COI基因的通用引物进行PCR扩增，将扩增得到的DNA片段进行测序，最后将测序结果与国际通用的DNA条形码数据库（如BOLD数据库）中的序列进行比对，根据序列相似度来确定鱼糜制品的原料鱼种。DNA条形码技术具有高通量、快速、准确的特点，能够同时对多个样品进行分析，适用于大规模的鱼种鉴别工作。此外，该技术建立的数据库可以不断更新和完善，有助于发现新物种和鉴别疑难物种。然而，DNA条形码技术也存在一定的局限性，如部分物种的条形码序列存在种内变异较大、种间差异较小的情况，可能导致鉴别误差；同时，数据库的完整性和准确性对鉴别结果有较大影响。

（四）环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术是一种新型的核酸等温扩增技术，其原理是利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在恒温条件下（一般为60-65℃），1小时内即可完成核酸的指数级扩增。在鱼糜制品原料鱼种鉴别中，LAMP技术具有独特的优势。由于反应在恒温条件下进行，不需要昂贵的PCR仪等设备，仅需水浴锅或恒温金属浴即可完成反应，操作简便、快速，适合现场检测。此外，LAMP反应的产物可以通过肉眼观察白色沉淀或利用荧光