病原生物学试验实验四-NK细胞活性测定.pptVIP

实验四MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性

（MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性）原理：1.制备小鼠脾细胞（含NK细胞）2.NK细胞与肿瘤细胞（YAC-1）共孵育，NK活性越强，肿瘤细胞被杀死越多。3.MTT底物可被活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色产物，死细胞无此功能；活细胞越多，颜色越深；据此推断活细胞或死细胞多少。4.经酶标仪比色后，可计算出NK细胞活性。

主要方法：（一）免疫细胞（小鼠脾NK细胞）的制备（二）NK细胞活性测定（MTT比色法）

MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性[方法]：1、靶细胞制备YAC-1细胞，洗涤，计数，调整至2×105/ml（已制备好，用前摇匀）2、效应细胞（脾NK细胞）制备处死小鼠，消毒取脾，制成脾细胞悬液，过滤，离心洗涤，计数，调整细胞浓度至2×106/ml。（具体操作如下）

（7）脾细胞沉淀用Hanks液洗2次（加入3mlHanks液，混匀，1500r/min，离心5min，倒去上清；重复上述步骤1次）；（8）用1ml1640培养液溶解脾细胞沉淀，混匀，配成脾细胞悬液（原液），计数（吸取10ul加入390ul白细胞稀释液中，稀释40倍，用血球计数板在显微镜下计数），根据P53页公式计算脾细胞悬液原液中脾细胞浓度；（9）吸取一定量脾细胞悬液原液，用1640培养液配制2×106/ml浓度的脾细胞悬液1毫升至2毫升，待用。3、细胞毒试验按表7-3加样，

4、孵育二氧化碳培养箱孵育2小时；加MTT，继续孵育2小时。5、测OD值轻轻吸弃上清，加二甲亚砜150ul，振荡10min，测OD值。6、结果分析

表7-3MTT法测NK细胞活性试验各组成分(3复孔/组)实验组靶细胞对照组效应细胞对照组空白对照靶细胞100ul100ul————效应细胞100ul——100ul——1640培养基——100ul100ul200ul（1-实验组OD值-效应细胞对照组OD值靶细胞对照组OD值）×100%NK细胞活性（%）=

附：P53细胞计数公式：细胞浓度（细胞数/ml原液）=4大格内的细胞总数4×10000×稀释倍数

DBCA