CN115927149B 一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用 （浙江大学杭州国际科创中心）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN115927149B(45)授权公告日2025.07.01

(21)申请号202211396234.3

(22)申请日2022.11.09

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN115927149A

(43)申请公布日2023.04.07

C12N

C12N

C12N

B09B

C12R

B09B

15/78(2006.01)

15/31(2006.01)

15/53(2006.01)

3/60(2022.01)

1/40(2006.01)

101/75(2022.01)

(73)专利权人浙江大学杭州国际科创中心

地址311200浙江省杭州市萧山区建设三

路733号

(72)发明人吴坚平梁天鑫黄磊张红玉杨立荣

(56)对比文件

CN113073072A,2021.07.06CN114008197A,2022.02.01审查员张怡文

(74)专利代理机构杭州初尘专利代理事务所(特殊普通合伙)33514

专利代理师万静

(51)Int.CI.

C12N1/21(2006.01)

权利要求书2页说明书7页序列表(电子公布)附图2页

(54)发明名称

一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和

应用

(57)摘要

CN115927149B本发明公开了一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用，该恶臭假单胞菌工程菌，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌的重组质粒；恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；重组质粒包含SEQIDNO.2或SEQIDNO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；或SEQIDNO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和SEQIDN0.3所示的对苯二甲酸转运模块。本发明以恶臭假单胞菌为出发菌株，通过敲除影响乙二醇代谢的关键内源基因，并在此基础上外源导入对苯二甲酸代谢模块和对苯二甲酸转运模

CN115927149B

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CN115927149B权利要求书1/2页

2

1.一种恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌满足自我复制的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；

所述重组质粒为以下之一：

(1)包含如SEQIDNO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块；

(2)包含如SEQIDNO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；

(3)包含如SEQIDNO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和如SEQIDNO.3所示的对苯二甲酸转运模块；

所述乙二醇代谢的关键基因为gclR,核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述恶臭假单胞菌的株型为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2440ATCCNO.47054。

3.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，对于(3),所述对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入至两不同的重组质粒上，且两重组质粒均满足在恶臭假单胞菌中自我复制并相容。

4.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pSEVA64。

5.一种如权利要求1～4任一项所述的恶臭假单胞菌工程菌的制备方法，其特征在于，包括：

(1)利用基因敲除技术将恶臭假单胞菌基因组影响乙二醇代谢的关键基因敲除，敲除后，进行实验室适应性进化，得到进化后的工程菌；

所述乙二醇代谢的关键基因为gclR,核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

(2)将核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块插入至原始表达载体上；或者，将核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的对苯二甲酸转运模块分别插入至两原始表达载体上，得到重组质粒；

(3)将重组质粒转化至敲除基因后的工程菌中，得到恶臭假单胞菌工程菌；所述实验室适应性进化的方法包括如下步骤：

(A)挑取LB固体培养基中的恶臭假单胞菌单菌落，接种至液体LB培养基中进行培养，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养12-16h,得到种子液体培养物；

(B)将步骤(A)得到的