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定点固载标签介导人PTH的表达纯化及纳米抗体淘选策略研究

一、引言

1.1研究背景

人甲状旁腺激素（humanParathyroidHormone,人PTH）是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，在人体钙磷代谢及骨骼健康中发挥着至关重要的作用。其主要生理作用包括调节血钙水平，当血钙降低时，PTH分泌增加，通过间接促进小肠黏膜上皮细胞吸收钙和磷，增加血钙水平，同时作用于肾脏，增强肾远曲小管和集合管对钙的重吸收，进一步升高血钙浓度；影响磷代谢，PTH抑制近端小管和远端小管重吸收磷，促进磷的排泄，从而使血磷降低，与调节血钙相辅相成，共同维持钙磷平衡；促进骨骼形成与吸收，PTH具有双重作用，在高浓度时，通过激活破骨细胞增强骨吸收作用，而在低浓度时，则通过促进成骨细胞活动而有利于骨形成。

PTH水平异常与多种疾病的发生发展密切相关。PTH分泌过多可引发原发性甲状旁腺功能亢进症，表现为高血钙、低血磷和骨骼病变，患者可能出现骨痛、骨折、泌尿系统结石等症状，严重影响生活质量。而PTH分泌不足则可导致甲状旁腺功能减退症，引发低钙血症，影响骨骼健康和神经传导，患者可出现手足抽搐、感觉异常等症状。因此，对人PTH的深入研究对于理解钙磷代谢机制、诊断和治疗相关疾病具有重要的临床意义。

在蛋白研究和生物制药领域，定点固载标签技术为蛋白质的研究提供了强大的工具。通过基因工程手段将具有特定功能的多肽序列、蛋白质结构域或完整蛋白与目标蛋白进行融合表达，实现了蛋白质检测的标准化和便捷化。例如，His标签（六个组氨酸残基组成的融合标签）可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化，其分子量小，一般不影响目标蛋白的功能，且可在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，适用于多种表达系统。AviTag标签通过在目标蛋白的N端或C端融合一段由15个氨基酸组成的短肽标签，可被生物素连接酶BirA特异性识别并催化生物素共价连接，实现对目标蛋白的特异性生物素标记，广泛应用于蛋白质固定化、纯化分离及显影检测等多个领域。定点固载标签技术能够实现目标蛋白的高效检测、纯化和定位追踪，极大地推动了蛋白质研究的发展。

纳米抗体（nanobody，Nb），也称为单域抗体或VHHs，是一类由重链抗体中的单一变量域（VH）区域衍生的抗体片段，最初从骆驼科动物中发现。纳米抗体具有诸多独特优势，其体积小，只有15kDa左右，约为传统抗体的十分之一大小，能够更容易地渗透到组织和细胞内部，识别难以达到的靶标。纳米抗体通常具有较高的亲和力，可以更牢固地与靶标结合，提高了检测的灵敏度和效果。由于其小尺寸和简单的结构，纳米抗体通常更稳定，能够耐受高温和极端pH环境。并且纳米抗体的单一结构使其更容易进行工程化，包括改变亲和力、稳定性和药物输送性能。这些优势使得纳米抗体在生物医药、研究和诊断领域展现出广阔的应用前景，如在肿瘤治疗中，纳米抗体-药物偶联、CAR-T、光动力疗法(PDT)、靶向放射性核素治疗等治疗方法不断研发改进，为癌症患者带来了新的希望；在病毒感染治疗方面，纳米抗体可作为中和抗病毒试剂，用于治疗动、植物病毒感染。

1.2研究目的和意义

本研究旨在通过基因工程技术，实现携带定点固载标签的人PTH在合适表达系统中的高效表达与纯化，为后续深入研究人PTH的结构与功能提供充足、高纯度的蛋白样品。深入了解人PTH的结构与功能，有助于揭示钙磷代谢的精细调控机制，为相关疾病的发病机制研究提供理论基础。同时，利用噬菌体展示或酵母展示等技术从构建的纳米抗体文库中淘选针对人PTH的高亲和力纳米抗体，为开发新型的诊断试剂和治疗药物奠定基础。

在诊断方面，高亲和力的纳米抗体可用于开发更加精确的检测人PTH水平的诊断试剂，提高甲状旁腺相关疾病的早期诊断准确率，有助于患者的及时治疗和预后改善。在治疗领域，基于纳米抗体开发的靶向治疗药物，具有特异性强、副作用小等优势，有望为甲状旁腺功能亢进症、甲状旁腺功能减退症等疾病的治疗提供新的策略和方法，为患者带来更好的治疗效果和生活质量。本研究对于推动人PTH相关疾病的基础研究和临床治疗的发展具有重要的理论和实践意义。

二、人PTH及相关技术概述

2.1人PTH的结构与功能

人PTH是由84个氨基酸组成的单链多肽，其氨基酸序列具有高度保守性。在空间结构上，人PTH的N端（1-34位氨基酸）形成较为规整的α-螺旋结构，该区域对于与甲状旁腺激素受体（PTHR）的结合及激活起着关键作用，其中前几个氨基酸残基直接决定了与受体结合的特异性和亲和力。肽链中包含多种不同性质的氨基酸，如带正电的精氨酸（A