高效液相色谱法原理及其应用.pptVIP

高效液相色谱法（HPLC）

;第一节高效液相色谱法基本原理;（一）高效液相色谱法的特点

;2．流动相的区别

GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。

HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作

用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余

地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到

调控作用，当选用不同比例的两种或两种以

上液体作为流动相也可以增大分离选择性。

;3．操作条件区别

GC：加温操作（※对气相色谱分离效率最有影响的因素）

HPLC：室温；高压

;三、高效液相色谱法的特点

;（二）高效液相色谱法的分类及分离机制;一、※液固吸附色谱法（LSC）

流动相为液体，固定相为固体吸附剂

分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异

调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间

出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱;※反相色谱——固定相极性流动相极性

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱

用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。

通常对于亲水固定液采用疏水性流动相

;四、空间排斥色谱法（SEC）;五、亲合色谱法（AC）;六、化学键合相色谱法（BPC）;按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较

;（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法;

;※（一）输液系统

一、储液装置：过滤器

二、脱气装置：脱气机

流动相脱气：

（1）吹氦脱气法

（2）加热回流法

（3）抽真空脱气法

（4）超声波脱气法

（5）在线真空脱气法;流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液相色谱分离的一个非常重要的实验因素。改变流动相的性质和组成将改变溶质组分的保留值、分离选择性和柱效。在实际工作中，流动相的可选择范围较大是液相色谱的一个显著特点。;※液相色谱中,?组分的保留值大小决定于组分与流动相和固定相分子间作用力：比如吸附、分配、离子交换、亲和力等。;往复柱塞泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，保证将流??相以稳定的速度流过色谱柱的部件。;2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。;;二、高压输液泵的基本要求：

1.流量范围宽

2.重现性和准确度好

3.输出的流动相无脉冲影响

4.输出压力高且耐压

5.密封性能好

6.具备压力检测和保护功能;三、高压输液泵的性能参数

;四、梯度洗脱装置;※梯度洗脱的原理：

流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。

;※梯度洗脱的优点：

1.缩短分析周期；

2.提高分离能力；

3.峰型得到改善，减少拖尾；

4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。;※（三）进样装置;进样阀的基本要求：

1.耐高压

2.进样量准确

3.进样重复性好

4.无流量和压力波动影响;进样阀的保护措施：

1.在泵和进样阀之间安装在线过滤器，防止机械杂质进入进样阀。

2.以缓冲液作流动相时，定期用水清洗进样阀，尤其是在色谱仪关机前。;自动进样器的组成部分：

1.进样阀

2.样品环管

3.进样针头

4.样品瓶

5.支架

;※（四）色谱柱;色谱柱的要求：

※柱效高：通过减小填料粒度来提高柱效

※选择性好：可通过改变固定相的种类和流动相的种类来改变色谱柱的选择性。

分析速度快;一、柱材料及规格

1．柱材料：色谱柱由柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成。

HPLC柱的填料材料有硅胶、以硅胶为基质的键合相、氧化铝和有机聚合物微球等。;2．※柱规格：粒度通常为3μm、5μm、7μm、10μm，柱长10～30cm，内径2～6mm，以4.6mm的内径最常用。目前以反相键合相色谱柱应用最多，尤其是C18、C8柱;二、色谱柱的性能评价

1.理论塔板数

2.不对称因子

3.保留值的重现性

;三、色谱柱的维护与保养

1.加流路过滤器和保护预柱

2.避免高压冲击

3.采用适合柱的分离条件：PH、柱温和流动相

4.过滤流动相和样品

5.用强溶剂定期冲洗柱;1.色谱柱的保养;（1）反相谱柱用后的保存：使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，每天实验结束后，应用20倍柱体积的甲醇/乙腈－水溶液（5%）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用高浓度的甲醇/乙腈－水溶液（80%～100%）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。;（2）※反相色谱柱长期保存：

反相柱可以储存于甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于经脱水处理的正己烷中，离子交换柱可以贮存于5%甲醇－水的溶液中，并将色谱柱两端的堵头拧紧，以免干枯，室温保存。;