DB41∕T 1728-2018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法.docxVIP

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DB41

河南省地方标准

DB41/T1728—2018

微生物法饲料添加剂丁酸梭菌的测定

微生物法

2019-02-26实施2018

2019-02-26实施

河南省质量技术监督局发布

DB41/T1728—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由河南省畜牧局提出并归口。

本标准起草单位:河南海瑞正检测技术有限公司、河南省兽药饲料监察所、河南省种牛遗传性能测定中心。

本标准主要起草人:朱慧慧、陆静、方忠意、李灵平、周永亮、黄好强、麻晓燕、王洋洋、范晓燕、魏金销。

DB41/T1728—2018

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饲料添加剂丁酸梭菌的测定微生物法

1范围

本标准规定了饲料添加剂丁酸梭菌的检测方法微生物法。

本标准适用于饲料及饲料添加剂中丁酸梭菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定

3培养基或材料

3.1亚硫酸铁琼脂培养基:见附录A中A.1。

3.20.85%生理盐水:见附录A中A.2。

3.3产酸指示培养基:见附录B中B.1。

3.4明胶培养基。

3.5淀粉水解培养基。

3.6革兰氏染色配套试剂:见附录A中A.3。

3.7胰蛋白胨大豆琼脂(TSW)。

注：除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水应符合GB/T6682中三级水的要求。

4仪器设备

4.1天平:感量0.01g。

4.2粉碎机。

4.3高压灭菌器。

4.4恒温培养箱。

4.5电热鼓风干燥箱。

4.6拍击式匀质器。

4.7厌氧罐（配厌氧产气袋）。

4.8超净工作台。

4.9移液器:100μL～1000μL。

4.10显微镜。

4.11酒精灯。

4.12试管架。

4.13灭菌试管:15mL。

4.14灭菌平皿:直径90mm。

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5测定步骤

5.1试样稀释及培养

5.1.1无菌条件下称取试样25g(mL)样品，加入装有225mL0.85%灭菌生理盐水的匀质袋中，然后用匀质器拍打2min～3min，制成1:10的均匀稀释液。

5.1.2用移液器移取1:10稀释液1mL，注入含有9mL0.85%灭菌生理盐水的试管中，充分混匀后，制成1:100的稀释液。

5.1.3按上述操作方法，10倍递增稀释，如此每递增稀释一次。

5.1.4选择2～3个适宜稀释度，用移液器移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，同时用1mL无菌生理盐水作对照。然后将凉至50℃左右的培养基注入平皿中，小心转动培养基使试样与培养基充分混匀。

5.1.5待培养基凝固后迅速将平皿倒置于培养箱中，37℃厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。

5.2菌落特征

亚硫酸铁琼脂培养基上，菌落圆形，较小、规则、实心，刚开始为黑色，放置1d～2d时间黑色褪为白色。

5.3确证试验

从平皿中选出5个特征菌落进行确证试验，在胰蛋白胨大豆琼脂平皿上进行纯化。挑选纯化的菌落做革兰氏染色和生化试验，生化试验项目如表1。

确证结果:革兰氏染色为阳性菌，菌体呈杆状，能形成圆形或椭圆形芽孢，菌体中部膨大呈梭形。

生化试验不水解明胶，水解淀粉，可以利用蜜二糖和葡萄糖产酸，不利用松三糖，鼠李糖和山梨醇，即可判定为丁酸梭菌。

表1生化鉴定

项目

明胶液化

淀粉水解

蜜二糖

松三糖

鼠李糖

山梨糖

葡萄糖

结果

-

+

+

-

-

-

+

注：-:阴性；+:阳性

6结果计算与报告

6.1计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数a，使用式（1）计算:

a=×C…………（1）

式中:

a----计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数；

b----挑选后经证实为丁酸梭菌的菌落数；

A----挑选平板上用于验证的菌落数；

C----平板上的所有特征菌落数。

最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。

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6.2样品中丁酸梭菌数的计算方法与报告

选择两个连续稀释度平板（每个稀释度至少有一块平板）