蛋白酶体抑制剂MG132对心衰鼠心肌缝隙连接蛋白CX43表达的影响.docxVIP

蛋白酶体抑制剂MG132对心衰鼠心肌缝隙连接蛋白CX43表达的影响

一、引言

心力衰竭（简称心衰）是各种心脏疾病发展的终末阶段，严重威胁着人类的健康和生命。心肌缝隙连接在心肌细胞间的电信号和化学信号传递中起着至关重要的作用，而缝隙连接蛋白CX43是心肌中最主要的缝隙连接蛋白，其表达和功能的异常与心衰的发生发展密切相关。蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制蛋白酶体的活性，调节细胞内蛋白质的降解。本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂MG132对心衰鼠心肌缝隙连接蛋白CX43表达的影响，为心衰的治疗提供新的思路和实验依据。

二、材料与方法

（一）实验动物

选用SPF级雄性SD大鼠，体重250-300g，购自[具体动物实验中心]。将大鼠随机分为三组：正常对照组（10只）、心衰模型组（10只）、MG132治疗组（10只）。

（二）主要试剂与仪器

蛋白酶体抑制剂MG132（购自[具体公司]）；

兔抗大鼠CX43多克隆抗体（购自[具体公司]）；

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（购自[具体公司]）；

RNA提取试剂盒（购自[具体公司]）；

逆转录试剂盒（购自[具体公司]）；

实时荧光定量PCR试剂盒（购自[具体公司]）；

离心机（型号：[具体型号]，购自[具体公司]）；

实时荧光定量PCR仪（型号：[具体型号]，购自[具体公司]）；

Westernblot电泳仪及转膜仪（型号：[具体型号]，购自[具体公司]）。

（三）心衰模型的建立

心衰模型组和MG132治疗组大鼠采用腹腔注射阿霉素（5mg/kg）的方法建立心衰模型，每周1次，连续注射6周。正常对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。

（四）给药方法

MG132治疗组大鼠在建立心衰模型的同时，腹腔注射MG132（0.5mg/kg），每周3次，连续注射6周。正常对照组和心衰模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。

（五）样本采集与处理

末次给药24小时后，将所有大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉，开胸取心脏，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，一部分心肌组织放入4%多聚甲醛中固定，用于免疫组织化学检测；另一部分心肌组织放入-80℃冰箱中保存，用于Westernblot和实时荧光定量PCR检测。

（六）免疫组织化学检测

将固定好的心肌组织进行石蜡包埋、切片，脱蜡至水，3%H?O?室温孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性，抗原修复后，滴加兔抗大鼠CX43多克隆抗体（1:200），4℃孵育过夜，次日滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1:500），37℃孵育30分钟，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察CX43的表达情况，采用Image-ProPlus6.0图像分析软件测定平均光密度值（IOD/Area），以反映CX43的表达水平。

（七）Westernblot检测

取-80℃保存的心肌组织，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上研磨匀浆，4℃离心（12000rpm，15分钟），取上清液，采用BCA法测定蛋白质浓度。取等量的蛋白质样品进行SDS电泳，然后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，滴加兔抗大鼠CX43多克隆抗体（1:1000）和β-actin单克隆抗体（1:5000），4℃孵育过夜，次日滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1:5000），室温孵育2小时，ECL化学发光显色，X线片曝光显影。采用ImageJ图像分析软件测定条带的灰度值，以CX43与β-actin灰度值的比值作为CX43的相对表达水平。

（八）实时荧光定量PCR检测

取-80℃保存的心肌组织，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，测定RNA的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应。CX43的上游引物：5-[具体序列]-3，下游引物：5-[具体序列]-3；β-actin的上游引物：5-[具体序列]-3，下游引物：5-[具体序列]-3。反应条件：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算CX43mRNA的相对表达水平。

（九）统计学分析

采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，P0.05为差异具有统计学意义。

三、结果

（一）三组大鼠一般情况比较

正常对照