高中生物动物细胞培养实验教案与试题.docxVIP

高中生物动物细胞培养实验教案与试题

一、动物细胞培养实验教案

（一）实验名称

动物细胞培养（以哺乳动物成纤维细胞为例，如小鼠胚胎成纤维细胞或鸡胚成纤维细胞）

（二）实验目的与要求

1.知识目标：理解动物细胞培养的基本原理（包括细胞生存的环境条件、营养需求、无菌操作的重要性等）；了解原代培养与传代培养的概念及主要区别。

2.能力目标：初步掌握动物细胞培养的基本操作技术，如无菌操作技术、组织块培养法或消化法、细胞观察与计数（若条件允许）、传代操作等；学会使用相关仪器设备，如超净工作台、CO?培养箱（或恒温培养箱）、倒置显微镜等。

3.情感态度与价值观目标：认识到细胞培养技术在生命科学研究中的重要性；培养严谨的科学态度、细致的观察能力和规范的实验操作习惯；增强生物安全意识。

（三）实验原理

动物细胞培养是指从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理），然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。细胞体外培养时，需要模拟体内环境，提供充足的营养（如葡萄糖、氨基酸、维生素等）、适宜的温度（37℃左右）、pH值（7.2-7.4）、气体环境（主要是O?和CO?，CO?用于维持培养液的pH）以及无菌、无毒的环境。原代培养是指从供体获取组织细胞后在体外进行的首次培养。当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，需要将其分散，接种到新的培养瓶中继续培养，这一过程称为传代培养。

（四）实验材料与试剂

1.实验材料：

*动物组织：如鸡胚（9-10日龄）或小鼠的幼龄组织（如胚胎、肾脏、肝脏等，具体根据实验条件和伦理要求选择）。

2.实验试剂：

*细胞培养液：常用DMEM或RPMI-1640培养液（含葡萄糖、氨基酸、无机盐等），添加适量胎牛血清（或小牛血清，提供生长因子等）、青霉素、链霉素（双抗，防止细菌污染）。

*平衡盐溶液：如PBS（磷酸缓冲盐溶液）或Hanks液，用于清洗组织、稀释细胞等。

*消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，用于分散组织块和贴壁细胞。

*75%乙醇溶液：用于消毒。

*无菌水。

3.实验仪器与器材：

*超净工作台、CO?培养箱（或恒温培养箱）、倒置显微镜。

*培养皿、培养瓶、离心管、吸管（或移液枪及配套吸头）、烧杯、剪刀、镊子、手术刀、血细胞计数板（可选）。

*酒精灯、酒精棉球、试管架、废物缸等。

（五）实验步骤与操作

1.准备阶段（无菌室/超净工作台内操作）：

*用75%乙醇擦拭超净工作台面、双手及所需仪器表面。

*将所需试剂（培养液、PBS、胰蛋白酶等）和器材放入超净工作台，打开紫外线灯照射消毒（通常15-30分钟），使用前关闭紫外灯，通风片刻。

2.取材与原代培养（以鸡胚成纤维细胞为例）：

*组织获取与处理：取9-10日龄鸡胚，无菌操作下取出胚胎，去除头、四肢及内脏，用PBS清洗胚胎躯干2-3次，去除血水。

*组织剪碎：将清洗后的胚胎躯干放入无菌培养皿中，用无菌剪刀将其剪成1mm3左右的小块，加入少量PBS或培养液。

*（可选）消化分散：若采用消化法，将组织块移入离心管，加入适量胰蛋白酶溶液，37℃水浴中消化（时间视组织块大小和硬度而定，通常10-20分钟），期间轻摇。待组织块变松散、边缘模糊时，加入含血清的培养液终止消化，用吸管轻轻吹打，使细胞分散。

*接种培养：

*组织块培养法：将剪碎的组织小块均匀铺在培养瓶底壁，轻轻翻转培养瓶，加入适量培养液（以能覆盖瓶底为宜），塞紧瓶塞。放入37℃恒温培养箱（若为CO?培养箱，需通入5%CO?），静置24小时后，再将培养瓶缓慢翻转，使培养液淹没组织块，继续培养。

*细胞悬液培养法（消化后）：将上述细胞悬液经适当离心（如1000转/分钟，5分钟），弃上清，加入新鲜培养液重悬细胞，计数（可选）后接种于培养瓶中，加入足量培养液，置于培养箱中培养。

3.细胞观察与换液：

*每日或隔日在倒置显微镜下观察细胞生长状况、形态变化及有无污染。

*当培养液变黄（pH下降）或出现浑浊时，需进行换液。换液时，在超净工作台内，小心吸出旧培养液，用PBS清洗1-2次，加入新鲜培养液。

4.传代培养（当细胞铺满瓶底约80%-90%时进行）：

*在超净工作台内，吸出培养瓶中的旧培养液。

*加入适量PBS清洗细胞表面1-2次，弃去。

*加入适量胰蛋白酶溶液，轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞层，置于37℃培养箱中消化数分钟（具体时间需镜下观察，见细胞间隙增大、细胞变圆时终止）。

*加入含血清的培养液终止消化，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使其脱落并分散成单个细胞悬液。

*将细胞悬液转移至离