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空肠弯曲菌cdtA、cdtB、cdtC基因的构建、表达及功能研究

一、引言

1.1空肠弯曲菌概述

空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）是一种革兰氏阴性菌，在全球范围内，它是导致人类细菌性腹泻的主要食源性病原体之一。其菌体轻度弯曲，呈逗点状、S形或螺旋状，长1.5-5μm，宽0.2-0.8μm，一端或两端带有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。该菌具有荚膜，但不形成芽胞。从培养特性来看，空肠弯曲菌属于微需氧菌，在含2.5-5%氧和10%CO?的环境中生长最佳，最适温度为37-42℃，在正常大气或无氧环境中难以生存。在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时后，可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落中心凸起，周边不规则，且无溶血现象。

在自然界中，空肠弯曲菌分布广泛，是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌，常见于它们的生殖道或肠道中。通过分娩或动物排泄物，空肠弯曲菌极易污染食物和饮水，进而导致人类感染。人群对空肠弯曲菌普遍易感，其中5岁以下儿童的发病率相对较高，发病时间多集中在夏秋季。相关研究数据显示，在欧洲，2018年报告了246,571例空肠弯曲菌感染病例，估算每年约有900万例人类感染；美国每年通过主动监测约有20例每10万人的感染病例，实际感染人数可能远超报告数据。在非洲、亚洲和中东地区，空肠弯曲菌感染呈地方性流行态势。

人感染空肠弯曲菌后，主要致病部位为空肠、回肠及结肠，潜伏期一般为3-5天。患者的主要症状表现为痉挛性腹痛、腹泻，腹泻物可为血便或果酱样便，且量较多，同时伴有头痛、不适、发热等症状。在一些严重的感染病例中，细菌可通过肠黏膜进入血流，引发败血症以及其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等。孕妇若感染该菌，还可能导致流产、早产，新生儿也有受感染的风险。

1.2细胞致死性肿胀毒素（CDT）

细胞致死性肿胀毒素（Cytolethaldistendingtoxin，CDT）是细菌毒素家族的重要成员，由Johnson和Lior首次在大肠杆菌（Escherichiacoli）的培养液上清中发现。在空肠弯曲菌的致病机制中，CDT起着关键作用，被认为是重要的毒力因子之一。

CDT的结构独特，由cdtA、cdtB、cdtC三个基因编码的蛋白质亚基组成，这三个亚基共同构成一个稳定的三聚体结构。其中，CdtB亚基具有核酸酶活性，这是CDT发挥生物学功能的核心部分。CdtA和CdtC亚基则主要负责协助CdtB亚基进入宿主细胞，它们通过与宿主细胞表面的受体结合，介导整个毒素分子内化进入细胞。

CDT的主要功能是干扰宿主细胞的正常生理进程。一旦进入细胞，CdtB亚基能够作用于宿主细胞的DNA，造成DNA双链断裂，进而引发细胞周期阻滞和细胞凋亡。具体而言，DNA损伤会激活细胞内的一系列应激反应通路，细胞周期检查点被激活，使细胞停滞在G2/M期，试图对损伤的DNA进行修复。若DNA损伤过于严重无法修复，细胞则会启动凋亡程序，最终导致细胞死亡。这种对宿主细胞的破坏作用，在空肠弯曲菌感染引发的肠道炎症以及其他相关疾病的发生发展过程中，扮演着关键角色，严重影响了肠道微生态平衡和机体的正常生理功能。

1.3cdtA、cdtB、cdtC基因研究现状

目前，针对空肠弯曲菌cdtA、cdtB、cdtC基因的研究已取得了一定成果。在基因克隆与测序方面，众多研究成功克隆出这三个基因，并完成了序列测定与分析，明确了不同菌株中这些基因的序列特征及差异，为后续研究奠定了坚实基础。在基因表达方面，研究者们尝试利用多种表达系统来表达这些基因，如大肠杆菌表达系统，通过优化表达条件，实现了目的蛋白的成功表达。同时，对于表达出的蛋白，也进行了纯化和鉴定工作，以获取高纯度、具有生物学活性的蛋白，用于后续功能研究。

然而，当前研究仍存在一些不足与空白。在基因表达调控机制方面，虽然已知某些环境因素和调控因子可能参与其中，但具体的调控网络和分子机制尚未完全明确。不同表达系统对这三个基因表达的影响也缺乏系统性研究，例如不同表达载体、宿主菌株以及培养条件等因素，如何影响基因的表达水平和蛋白的活性，还需要进一步深入探索。此外，关于这三个基因在空肠弯曲菌感染过程中的协同作用机制，目前的研究还不够深入，对于它们如何相互配合、共同影响空肠弯曲菌的致病性，仍有待更多的实验和分析来揭示。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与载体

实验所用的空肠弯曲菌菌株为本实验室前期从临床腹泻患者粪便样本中分离并保存的菌株，经过16SrRNA基因测序及生化鉴定，确定为典型的空肠弯曲菌。该菌株在含5%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼