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携带Livin基因的质粒扩增及在DC中的表达实验指南

一、背景介绍

Livin基因是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成员，其编码的蛋白能通过抑制caspases家族活性来阻断细胞凋亡过程，在肿瘤发生、发展及免疫调节中发挥着关键作用。树突状细胞（DC）作为体内功能最强的抗原呈递细胞，是连接innate免疫和adaptive免疫的桥梁，其成熟状态和功能直接影响免疫应答的强度与方向。将携带Livin基因的质粒导入DC并实现有效表达，可为研究Livin对DC凋亡及免疫功能的调控机制提供重要实验基础，在肿瘤免疫治疗等领域具有潜在应用价值。

二、携带Livin基因的质粒扩增

（一）质粒提取（原始质粒模板制备）

实验材料准备：含携带Livin基因质粒的甘油菌、LB液体培养基（含对应抗生素，如氨苄青霉素）、离心机、超净工作台、培养箱等。

操作步骤：

在超净工作台中，取10μL含目的质粒的甘油菌接种于5mLLB液体培养基（含适宜浓度抗生素）中，37℃、220r/min摇床培养过夜（12-16h）。

取1.5mL培养物于离心管中，12000r/min离心1min，弃上清，收集菌体沉淀。

采用碱裂解法或质粒提取试剂盒提取质粒：若使用试剂盒，按照说明书依次加入溶液Ⅰ（含RNase）、溶液Ⅱ（裂解菌体）、溶液Ⅲ（中和反应），离心后取上清，经吸附柱纯化、洗涤、洗脱，获得原始质粒模板。

质量检测：通过1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒完整性，若出现清晰的超螺旋条带，无明显降解则合格；使用紫外分光光度计测定质粒浓度和纯度，A260/A280比值在1.8-2.0之间表明纯度较高。

（二）感受态细胞制备（氯化钙法）

实验材料：大肠杆菌DH5α菌株、LB固体培养基、0.1mol/LCaCl?溶液（预冷）、离心机、冰盒等。

操作步骤：

挑取DH5α单菌落接种于5mLLB液体培养基，37℃、220r/min培养过夜。

取1mL过夜培养物转接至100mLLB液体培养基，37℃摇床培养至OD???为0.3-0.5（约2-3h）。

将菌液转移至预冷的离心管，冰浴30min，4℃、4000r/min离心10min，弃上清。

用50mL预冷的0.1mol/LCaCl?溶液重悬菌体，冰浴30min，4℃、4000r/min离心10min，弃上清。

加入2mL预冷的0.1mol/LCaCl?溶液（含15%甘油）重悬菌体，分装成100μL/管，-80℃冻存备用。

（三）质粒转化

实验材料：制备好的感受态细胞、提取的目的质粒、LB固体培养基（含抗生素）、恒温水浴锅、培养箱等。

操作步骤：

取出感受态细胞，冰浴解冻，加入1-5μL目的质粒，轻轻混匀，冰浴30min。

42℃水浴热激90s，迅速冰浴2min。

加入900μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、150r/min摇床培养1h（复苏细胞并表达抗性基因）。

取100μL培养物均匀涂布于含对应抗生素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜（12-16h）。

（四）阳性克隆筛选与扩大培养

筛选方法：挑选培养基上生长的单菌落，接种于含抗生素的LB液体培养基，37℃、220r/min培养6-8h，提取质粒后通过琼脂糖凝胶电泳或PCR鉴定阳性克隆（以Livin基因特异性引物进行扩增，出现预期大小条带则为阳性）。

扩大培养：将阳性克隆菌液按1:100比例转接至大量LB液体培养基（含抗生素），37℃、220r/min培养12-16h，直至菌液OD???达到1.0-1.5。

（五）质粒大量提取与纯化

采用大提试剂盒进行操作：

取扩大培养的菌液，4℃、6000r/min离心10min，收集菌体。

依次加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，充分混匀并离心，收集上清。

将上清通过吸附柱，经洗涤液洗涤后，用洗脱液洗脱质粒。

检测质粒浓度和纯度（同前），-20℃保存备用。

三、携带Livin基因的质粒在DC中的表达

（一）DC的制备（外周血单核细胞诱导法）

材料准备：健康人外周血、Ficoll密度梯度离心液、RPMI1640培养基（含10%胎牛血清）、重组人GM-CSF和IL-4、培养瓶、离心机等。

操作步骤：

外周血经肝素抗凝后，与等量生理盐水混匀，缓慢叠加于Ficoll液上，20℃、400×g离心30min，吸取中间白膜层（单核细胞）。

用生理盐水洗涤单核细胞2次，调整细胞浓度至1×10?/mL，接种于培养瓶，37℃、5%CO?培养箱培养2h（让单核细胞贴壁）。

弃去未贴壁细胞，加入含1000U/mL