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双重实时荧光定量PCR技术检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌

一、引言

1.1研究背景

(1)随着全球人口的增长和城市化进程的加快，食品安全问题日益凸显。食品中微生物污染是引起食源性疾病的主要因素之一，而沙门氏菌和大肠埃希菌是两种常见的食源性致病菌。据统计，每年全球约有5亿人因食源性疾病而患病，其中约120万人死亡。在中国，食源性疾病的发生率也在逐年上升，据统计，2019年全国食源性疾病报告病例数为297.8万例，较2018年增长5.6%。沙门氏菌和大肠埃希菌污染的食品不仅对人类健康构成威胁，还可能引起严重的经济损失。

(2)中药作为一种传统药物，在中国乃至全球范围内具有广泛的应用。然而，中药制剂的质量安全问题也日益受到关注。近年来，中药材种植过程中农药残留、重金属污染等问题频发，这些都可能影响中药制剂的安全性。此外，中药制剂中微生物污染也是一大隐患。沙门氏菌和大肠埃希菌等致病菌的存在，不仅可能导致人体感染，还可能引发严重的健康问题。例如，2018年，某地一家中药企业生产的复方感冒颗粒因检出沙门氏菌而被召回，造成了较大的社会影响和经济损失。

(3)双重实时荧光定量PCR技术作为一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测方法，近年来在微生物检测领域得到了广泛应用。该方法能够实现对目标微生物的快速、准确检测，具有操作简便、结果稳定等优点。相较于传统的培养法，双重实时荧光定量PCR技术具有更短的检测周期和更高的检测灵敏度，这对于及时发现和防控食源性疾病具有重要意义。例如，在2017年的一起食源性疾病爆发事件中，利用双重实时荧光定量PCR技术成功检测出了引起疾病的沙门氏菌，为疾病的控制提供了科学依据。

1.2研究目的

(1)本研究旨在建立一种基于双重实时荧光定量PCR技术的方法，用于快速、准确地检测中药制剂中的沙门氏菌和大肠埃希菌。通过优化实验条件，提高检测的灵敏度和特异性，确保在中药制剂的微生物质量监控中发挥重要作用。

(2)研究目的是为了评估中药制剂在生产和流通环节中沙门氏菌和大肠埃希菌的污染风险，为中药制剂的安全性和质量控制提供科学依据。通过该方法的应用，有助于预防食源性疾病的发生，保障公众健康。

(3)此外，本研究还旨在探索双重实时荧光定量PCR技术在中药制剂微生物检测中的实际应用价值，为中药行业的微生物质量控制提供技术支持，推动中药产业的健康发展。通过本研究的实施，有望提高中药制剂的质量标准，增强消费者对中药产品的信任度。

1.3研究意义

(1)研究中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌的双重实时荧光定量PCR检测方法具有重要的理论意义。该方法不仅能够提高中药制剂微生物检测的效率和准确性，还为中药质量控制的科学研究提供了新的技术手段。这对于推动中药现代化、国际化进程具有积极作用。

(2)在实践意义上，该研究有助于提高中药制剂的质量安全水平，降低食源性疾病的发生风险。通过对中药制剂中微生物污染的早期检测和监控，可以有效防止不合格产品流入市场，保障消费者的用药安全，对维护社会公共卫生具有重要意义。

(3)此外，本研究的结果可为中药生产企业和监管部门提供技术支持，有助于规范中药生产过程，提升中药产品质量。同时，该研究还可为其他食品微生物检测方法的研发和应用提供参考，对整个食品微生物检测领域的发展具有推动作用。

二、双重实时荧光定量PCR技术原理

2.1实时荧光定量PCR技术概述

(1)实时荧光定量PCR（Real-timequantitativePCR，RT-qPCR）是一种在DNA扩增过程中实时监测和定量目标DNA序列的方法。该技术自20世纪90年代以来，因其高灵敏度、高特异性和快速检测等优点，在分子生物学、医学、环境科学等领域得到了广泛应用。RT-qPCR的基本原理是利用PCR技术扩增目标DNA序列，同时结合荧光标记的寡核苷酸探针，在PCR反应过程中实时检测荧光信号的强度，从而实现对目标DNA的定量分析。

(2)在RT-qPCR中，荧光信号的检测是通过荧光染料或荧光探针实现的。荧光染料如SYBRGreenI是一种非特异性荧光染料，它能够与双链DNA结合并发出荧光，从而实现对PCR产物的定量。而荧光探针则是一种特异性结合于目标DNA序列的寡核苷酸分子，它包含一个荧光标记和一个淬灭基团。在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合后，荧光标记的荧光会被淬灭基团吸收，导致荧光信号消失。随着PCR反应的进行，目标DNA序列被扩增，荧光探针与DNA的解离导致荧光信号恢复，从而可以实时监测荧光信号的强度变化。

(3)RT-qPCR技术具有多种优势，包括：1）实时监测，可以在PCR反应过程中随时检测目标DNA的扩增情况，提高检测的灵敏度和准确性；2）定量分析，通过比较标准曲线和样品的荧光信号强度，可以准确计