重组基因导入受体细胞的流程操作.pptxVIP

重组基因导入受体细胞的流程操作基因工程的关键步骤与技术细节不同导入方法的优缺点比较目的基因表达与检测的关键环节作者：

导言：重组DNA技术的基础基因工程核心按人类意愿在体外重组DNA分子，创造新的基因功能。关键步骤重组DNA导入受体细胞是基因工程第三步，也是至关重要的环节。重要意义成功导入是目的基因表达和扩增的前提，决定后续研究成败。

重组DNA的概念多源DNA组合不同生物来源的DNA片段经人工手段进行重新组合。分子连接目的基因与载体的精确连接形成重组DNA分子。功能性创新人工构建的新型功能性基因分子，具有特定表达功能。

基因工程的主要步骤目的基因获取通过PCR扩增或限制性内切酶切割分离特定基因片段。基因重组利用酶切和连接，将目的基因与适当载体结合。导入受体细胞使用各种方法将重组DNA引入宿主细胞内。检测与表达筛选成功转化的细胞，验证目的基因的表达。

重组DNA的构建原理限制性内切酶切割酶切产生互补的黏性末端，为重组创造条件。互补配对目的基因与载体的黏性末端通过碱基互补结合。DNA连接酶催化形成磷酸二酯键，牢固连接两个DNA片段。重组分子形成完整闭合的重组DNA分子具备完全功能。

重组DNA构建示例：人胰岛素基因1质粒切割使用限制酶切割质粒载体，形成特定的黏性末端。2基因处理同样的酶切割人胰岛素基因，获取相同的黏性末端。3分子结合碱基互补配对，通过氢键临时连接两个分子。4酶促连接DNA连接酶催化形成稳定的磷酸二酯键。

常用的受体细胞类型原核生物大肠杆菌、枯草杆菌等细菌是最常用的基因工程受体。真核微生物酵母菌作为真核生物模型，可进行复杂蛋白表达。植物受体土壤农杆菌是植物基因转化的重要媒介。动物细胞CHO、HEK293等哺乳动物细胞可表达复杂蛋白。

受体细胞选择的考虑因素生长特性受体细胞的生长速度与繁殖能力影响产量。表达效率外源基因在受体内的转录翻译效率。操作难度基因导入与筛选的技术复杂程度。产物提取目的产物的分离纯化难度与成本。

基因导入方法概览化学法氯化钙转化法、磷酸钙共沉淀法物理法电穿孔、基因枪、微注射生物法病毒转导、细菌介导转化不同方法适用于不同类型的受体细胞。选择合适的导入技术是成功率的关键。

细菌转化的机制原理通透性增加特定处理使细胞壁结构松动，增大通透性。DNA穿膜质粒DNA通过暂时形成的孔道穿过细胞膜。质粒存在形式外源DNA作为独立复制单位在细胞内稳定存在。影响因素温度、离子浓度、DNA纯度影响转化效率。

化学法：氯化钙转化法通透性处理氯化钙处理增大细胞壁通透性，形成感受态细胞。二价阳离子中和细胞表面电荷，减少排斥力。热激导入热激处理（42℃）促进DNA进入细胞内部。温度变化导致膜流动性改变，有利于DNA通过。方法优势操作简单，成本低廉，适用于大多数实验室。是细菌转化的经典方法，效率较为稳定。

氯化钙转化法操作步骤细菌培养培养至对数生长期，活性最佳感受态处理冰浴中氯化钙溶液处理3DNA加入加入重组DNA并冰浴孵育热激处理42℃短时处理后迅速冰浴选择性培养含抗生素平板筛选转化菌

电穿孔导入法原理机制强电场作用下细胞膜形成瞬时微孔。膜电位变化导致孔道形成，DNA通过扩散进入。方法特点转化效率高，适用范围广。可用于各种细胞类型，包括难转化的细胞。需要专业设备，操作参数要求精确。

电穿孔法操作步骤细胞洗涤去离子水洗涤去除培养基和盐离子。混合准备细胞与DNA混合，放入专用电击杯。电脉冲处理特定参数电脉冲瞬时处理细胞。恢复培养立即加入恢复培养基，修复细胞膜。

基因枪导入法微粒包裹金或钨微粒表面包裹DNA分子。贵金属微粒直径通常在1微米左右。高速轰击高压气体或电力将微粒加速至高速。微粒能量足以穿透细胞壁和细胞膜。应用领域主要用于植物细胞和组织的转化。可直接导入细胞核，适合转化完整组织。

病毒转导法感染特性利用病毒天然的细胞感染和基因导入能力。腺病毒系统不整合基因组，适合短期高效表达。逆转录病毒整合宿主基因组，实现长期稳定表达。安全考量需评估免疫原性和潜在生物安全风险。

噬菌体导入法噬菌体特性利用噬菌体特异性感染细菌的能力。基因组整合噬菌体DNA可整合到宿主基因组中。高效导入对特定细菌具有极高的转化效率。容量限制可携带的外源DNA大小有一定限制。

农杆菌介导的植物基因导入农杆菌感染农杆菌识别并附着在植物细胞表面Ti质粒转移T-DNA从细菌转移至植物细胞基因组整合外源DNA整合到植物染色体中3表达与再生转基因细胞培养发育成完整植株

动物细胞的基因导入方法脂质体转染利用脂质体包裹DNA形成复合物，通过胞吞作用进入细胞。操作简单，转染效率高，适用多种细胞类型。钙磷酸盐共沉淀DNA与磷酸钙形成沉淀，细胞通过吞噬作用摄入。成本低廉，但效率相对较低，细胞毒性较大。微注射直接将DNA注入细胞核，效率极高但技术要求高。适用于胚胎干细胞、受精卵等特