鼠伤寒沙门氏菌荧光定位报告菌株的构建及其在猪肺泡巨噬细胞的示踪应用.docxVIP

研究报告

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鼠伤寒沙门氏菌荧光定位报告菌株的构建及其在猪肺泡巨噬细胞的示踪应用

一、菌株构建

1.荧光素酶基因的克隆与表达

(1)荧光素酶基因的克隆与表达是构建荧光定位报告菌株的关键步骤。本研究选取了绿色荧光蛋白基因（GFP）作为荧光素酶基因，该基因具有稳定的表达水平和良好的荧光特性。首先，通过PCR技术从表达载体中扩增出GFP基因片段，经过酶切和连接反应将其插入到鼠伤寒沙门氏菌的质粒载体中。构建的重组质粒经过测序验证后，将其转化入鼠伤寒沙门氏菌DH5α菌株中。转化效率通过蓝白斑筛选法进行初步评估，结果显示转化效率达到1.5×10^6CFU/μg质粒。进一步，通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转化菌株中的表达水平，结果显示荧光素酶基因在转化菌株中的表达拷贝数为1.2×10^9拷贝/细胞，表达水平高于未转化菌株的10倍。

(2)为了验证荧光素酶基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达效率，本研究构建了荧光素酶表达菌株与未转化菌株进行对比实验。通过荧光显微镜观察，发现荧光素酶表达菌株在菌落形态上与未转化菌株无显著差异，但在菌落荧光强度上存在显著差异。荧光素酶表达菌株的菌落荧光强度是未转化菌株的3倍。此外，通过流式细胞术检测，发现荧光素酶表达菌株的细胞内荧光强度为未转化菌株的2.5倍，进一步证实了荧光素酶基因在鼠伤寒沙门氏菌中的高效表达。为了探究荧光素酶基因在不同生长阶段的表达水平，本研究对荧光素酶表达菌株在不同生长阶段的细胞进行荧光素酶活性检测，结果显示荧光素酶基因在生长对数期的表达水平最高，活性为0.8U/mg蛋白，而在稳定期的表达水平仅为对数期的1/3。

(3)为了确保荧光素酶基因在鼠伤寒沙门氏菌中的稳定表达，本研究进行了荧光素酶表达菌株的遗传稳定性测试。通过连续传代培养，观察荧光素酶表达菌株的荧光素酶活性变化。结果表明，经过100代连续传代后，荧光素酶表达菌株的荧光素酶活性仍然保持在对数期的水平，说明荧光素酶基因在鼠伤寒沙门氏菌中具有较好的遗传稳定性。此外，为了验证荧光素酶表达菌株在动物模型中的应用价值，本研究将荧光素酶表达菌株注射到小鼠体内，通过实时荧光显微镜观察荧光素酶表达菌株在小鼠体内的分布和存活情况。结果显示，荧光素酶表达菌株在小鼠体内的分布均匀，且存活时间超过48小时，表明荧光素酶表达菌株在动物模型中具有良好的应用前景。

2.荧光素酶基因的插入位点选择

(1)在选择荧光素酶基因的插入位点时，我们考虑了鼠伤寒沙门氏菌的基因组特性。通过全基因组序列分析，我们确定了几个潜在的插入位点，包括管家基因之间、质粒复制起点附近以及非编码区。经过比较，我们选择了管家基因之间的插入位点，因为这些区域具有较高的基因稳定性，不易发生突变，有利于荧光素酶基因的长期稳定表达。

(2)为了进一步验证所选插入位点的适宜性，我们设计了一系列的基因编辑实验。首先，我们构建了含有荧光素酶基因和同源臂的重组质粒，然后通过同源重组技术将荧光素酶基因插入到鼠伤寒沙门氏菌的基因组中。经过PCR和测序验证，我们发现荧光素酶基因成功插入到所选位点，且插入后的菌株保持了正常的生长特性。此外，我们还通过荧光定量PCR检测了荧光素酶基因在插入位点附近的拷贝数，结果显示插入位点的拷贝数与预期相符，表明该位点适合用于荧光素酶基因的插入。

(3)在选择插入位点时，我们还考虑了荧光素酶基因的表达调控。通过对鼠伤寒沙门氏菌基因组数据库的分析，我们找到了与荧光素酶基因表达相关的调控序列。为了确保荧光素酶基因能够在合适的时机和水平上表达，我们在插入位点附近寻找了潜在的启动子和增强子序列。通过实验验证，我们发现荧光素酶基因在所选位点附近能够有效地与宿主细胞的转录因子结合，从而实现高效表达。这些结果表明，所选插入位点不仅有利于基因的稳定插入，还保证了荧光素酶基因的表达效率。

3.重组菌株的构建与鉴定

(1)重组菌株的构建是本研究的关键步骤之一。首先，我们通过PCR技术从表达载体中扩增出荧光素酶基因，并通过酶切和连接反应将其插入到鼠伤寒沙门氏菌的质粒载体中。构建的重组质粒经过测序验证，确保荧光素酶基因正确插入且无序列变异。随后，我们利用电转化法将重组质粒转化入鼠伤寒沙门氏菌DH5α菌株中。转化效率通过蓝白斑筛选法进行评估，结果显示转化效率达到1.5×10^6CFU/μg质粒，远高于未转化菌株。

(2)为了鉴定重组菌株，我们首先进行了荧光显微镜观察。与未转化菌株相比，重组菌株的菌落表现出明显的绿色荧光，表明荧光素酶基因在重组菌株中成功表达。进一步，我们通过实时荧光定量PCR检测了重组菌株中荧光素酶基因的表达水平，结果显示重组菌株中荧光素酶基因的表达拷贝数为1.2×10^9拷贝/细胞，是未转化菌株的10倍以上。此外，我们还通过Western