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研究报告

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表达副猪格拉瑟菌GAPDH和OmP26的重组沙门氏菌构建与免疫学评价

一、1.重组沙门氏菌构建

1.1.重组质粒的构建

在重组质粒的构建过程中，首先需要对目标基因进行克隆。通过PCR技术，从副猪格拉瑟菌中扩增出GAPDH基因和OmP26基因，这两个基因分别编码副猪格拉瑟菌的关键蛋白。为了确保基因的正确插入，我们对PCR产物进行了纯化，并使用双链DNA测序对插入序列进行了验证。接着，我们将GAPDH和OmP26基因插入到经过优化的表达载体pET-28a(+)中，构建成重组质粒pET-GAPDH和pET-OmP26。在这个过程中，我们采用了限制性内切酶进行酶切，并通过DNA连接酶实现基因片段与载体的连接。为了保证重组质粒的稳定性，我们在连接过程中添加了合适的连接缓冲液和DNA连接酶，确保连接反应在适宜的温度和时间内完成。

为了检测重组质粒是否成功构建，我们对质粒进行了酶切分析。首先，使用相应的限制性内切酶对重组质粒进行酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行分离和观察。通过对比预期条带，我们验证了GAPDH和OmP26基因已成功插入到pET-28a(+)载体中。此外，为了进一步验证重组质粒的稳定性，我们还进行了质粒的扩增实验。将重组质粒转化到大肠杆菌中，通过扩增获得大量的质粒DNA，再进行酶切分析和PCR验证，以确保重组质粒的稳定性和表达载体的有效性。

在完成重组质粒的构建后，我们对质粒进行了测序分析。将重组质粒送往测序公司进行双向测序，以确保GAPDH和OmP26基因的序列与预期完全一致，并且没有发生插入突变或其他基因的污染。测序结果与已知的基因序列进行比对，进一步验证了重组质粒的正确性。此外，我们还对质粒的质粒酶切图谱进行了分析，以确保载体中的其他元件和基因没有受到影响。通过以上步骤，我们成功构建了含有GAPDH和OmP26基因的重组质粒，为后续的蛋白表达和免疫学评价奠定了基础。

1.2.重组质粒的鉴定

(1)鉴定重组质粒的过程首先从质粒的提取开始。采用标准的质粒提取方法，从转化了大肠杆菌的重组质粒中提取DNA。提取过程中，我们严格控制了操作步骤，确保了质粒DNA的纯度和完整性。提取后的质粒DNA通过紫外分光光度计进行定量，以确定其浓度和纯度。

(2)为了鉴定重组质粒是否成功构建，我们首先进行了PCR扩增。针对插入的GAPDH和OmP26基因设计特异性引物，对提取的质粒DNA进行PCR扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否出现了预期的DNA条带。通过对比Marker的分子量，我们确认了扩增产物的大小，从而验证了目标基因的插入。

(3)此外，我们还对重组质粒进行了酶切分析。选择与插入基因对应的限制性内切酶对质粒DNA进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段。通过对比酶切片段与预期片段的大小，我们验证了重组质粒中目标基因的插入位置和方向。同时，我们还对酶切后的质粒DNA进行了测序分析，以确认酶切位点是否正确，以及目标基因是否完整插入。

(4)在进行PCR和酶切分析的同时，我们还对重组质粒的载体进行了鉴定。通过PCR扩增载体上的特定序列，以及通过酶切分析载体上的酶切位点，我们验证了载体的完整性和正确性。这些鉴定步骤确保了重组质粒的构建质量，为后续的蛋白表达和免疫学评价提供了可靠的实验材料。

(5)为了进一步验证重组质粒的稳定性，我们对转化后的细菌进行了多次传代培养。在每次传代后，我们提取质粒DNA，进行PCR和酶切分析，以确保质粒的稳定性。通过多次传代实验，我们观察到质粒的酶切图谱和PCR产物大小保持一致，证明了重组质粒的稳定性。

(6)最后，我们还对重组质粒进行了生物信息学分析。通过比较重组质粒的序列与已知的GAPDH和OmP26基因序列，我们验证了基因的正确插入和表达载体的正确性。此外，我们还对质粒中的启动子、终止子等调控元件进行了分析，以确保基因在宿主细胞中的正确表达。

通过以上鉴定步骤，我们成功验证了重组质粒的构建质量，为后续的蛋白表达和免疫学评价实验提供了可靠的实验材料。这些鉴定结果为后续的研究提供了坚实的基础，有助于我们深入了解副猪格拉瑟菌GAPDH和OmP26蛋白的功能和免疫学特性。

1.3.重组质粒的稳定性分析

(1)在进行重组质粒的稳定性分析中，我们首先对转化后的细菌进行了多次传代培养。在每次传代后，我们随机选取一定数量的细菌进行质粒提取，并通过PCR和酶切分析检测质粒的稳定性。经过30次传代后，我们发现质粒的PCR产物大小和酶切图谱与原始质粒保持一致，表明质粒在传代过程中保持了较高的稳定性。

(2)为了进一步验证质粒的稳定性，我们对传代培养后的细菌进行了质粒浓度测定。通过紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度，结果显示在30次传代过程中