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研究报告

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多重食源性致病菌快速实时荧光定量PCR检测技术的建立

一、1.技术背景

1.1食源性致病菌的危害

(1)食源性致病菌是引发食源性疾病的主要原因，这些疾病不仅给人们的健康带来严重威胁，而且对社会经济也造成巨大损失。据世界卫生组织（WHO）统计，每年全球有数百万人因食源性疾病而住院，数十万人因此死亡。例如，2011年美国爆发的大肠杆菌O104:H4疫情，导致超过2,500人感染，其中约500人需要接受血液透析治疗，10人死亡。

(2)食源性致病菌的危害主要体现在以下几个方面：首先，它们可以导致急性肠胃炎，表现为腹泻、呕吐、腹痛等症状，严重时可引发脱水、电解质紊乱甚至死亡；其次，某些致病菌如李斯特菌、沙门氏菌等可引起慢性疾病，如慢性肠胃炎、关节炎等，对患者的长期健康造成影响；此外，孕妇、婴幼儿、老年人等免疫系统较弱的人群感染食源性致病菌后，病情更为严重，死亡率更高。

(3)食源性致病菌的传播途径广泛，包括生食或未煮熟的食品、被污染的餐具、水源等。例如，2018年中国发生的一起沙门氏菌疫情，因食用被污染的鸡蛋而爆发，导致超过100人感染，其中多数为儿童。这些案例表明，食源性致病菌的危害不容忽视，加强食源性致病菌的检测和防控工作，对于保障公众健康具有重要意义。

1.2食源性致病菌检测的现状

(1)食源性致病菌检测是食品安全监管的重要环节，目前，全球范围内已建立了一系列检测方法和标准。传统检测方法主要包括培养法、显微镜观察、生化试验等，但这些方法存在检测周期长、灵敏度低、操作复杂等缺点。例如，培养法通常需要3-7天才能得到结果，无法满足快速检测的需求。

(2)随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR（qPCR）技术逐渐成为食源性致病菌检测的主流方法。qPCR技术具有快速、灵敏、特异等优点，可在数小时内完成检测。据统计，全球已有超过80%的食源性致病菌检测实验室采用qPCR技术。然而，qPCR技术也存在一些局限性，如引物和探针的设计、反应条件优化等对实验人员的技术要求较高。

(3)近年来，随着高通量测序技术的发展，食源性致病菌检测领域也迎来了新的突破。高通量测序技术可以快速、准确地检测大量微生物，为食源性致病菌的溯源和流行病学调查提供了有力支持。例如，2016年美国爆发的一起大肠杆菌O157:H7疫情，通过高通量测序技术，研究人员成功追踪到了污染源，为疫情的控制提供了重要依据。尽管如此，高通量测序技术成本较高，对实验室设备和人员的技术要求也较高，限制了其在基层实验室的广泛应用。

1.3实时荧光定量PCR技术的优势

(1)实时荧光定量PCR（qPCR）技术在食源性致病菌检测中展现出显著优势。首先，其检测速度极快，通常在数小时内即可完成，远优于传统培养法，后者往往需要数天时间。例如，在2017年美国爆发的一起沙门氏菌疫情中，使用qPCR技术仅用了6小时就确认了病原体，极大地缩短了疫情响应时间。

(2)qPCR技术的灵敏度极高，能够检测到极低浓度的病原体，甚至达到pg级别。这意味着即使在复杂的食品样本中，也能准确检测出食源性致病菌的存在。例如，在检测牛奶中的阪崎肠杆菌时，qPCR技术的灵敏度可达到10cfu/mL，远高于传统培养法的100cfu/mL。

(3)qPCR技术具有高度的特异性，能够区分不同种类的病原体，避免误诊。这一特性对于食源性疾病的快速诊断和溯源至关重要。在2015年欧洲爆发的大肠杆菌O26疫情中，qPCR技术帮助研究人员准确识别了病原体，为疫情的防控提供了科学依据。此外，qPCR技术的自动化程度高，减少了人为误差，提高了检测结果的可靠性。

二、2.检测对象及目标

2.1常见食源性致病菌种类

(1)食源性致病菌种类繁多，其中一些常见的致病菌对人类健康构成严重威胁。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，据统计，全球每年约有2000万例沙门氏菌感染病例，其中约100万人需要住院治疗。沙门氏菌感染主要来源于家禽、家畜、蛋类和乳制品等食品，常见的血清型包括沙门氏菌O157:H7、O45、O91等。

(2)大肠杆菌是另一类重要的食源性致病菌，其中大肠杆菌O157:H7是引起出血性大肠杆菌病的罪魁祸首。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，每年美国约有10万例大肠杆菌O157:H7感染病例，其中约1万人需要住院治疗。除了O157:H7外，其他大肠杆菌血清型如O26、O45、O103等也可引起严重的食源性疾病。

(3)李斯特菌是第三种常见的食源性致病菌，其感染主要发生在免疫力较低的人群中，如孕妇、老年人、新生儿等。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有5000例李斯特菌感染病例，其中约500人死亡。李斯特菌主要存在于生肉、熟肉、乳制品、蔬菜和水