纳米粒介导人arresten基因转染对兔移植静脉内膜增生的抑制作用.docxVIP

纳米粒介导人arresten基因转染对兔移植静脉内膜增生的抑制作用

一、研究背景

在临床治疗中，静脉移植是解决血管闭塞等问题的重要手段，然而移植后静脉内膜增生常常导致移植失败，这一问题一直困扰着医学界。内膜增生会使血管管腔狭窄，影响血液流通，严重降低移植静脉的使用寿命和治疗效果。

近年来，基因治疗为解决这一难题提供了新的思路。arresten基因作为一种具有潜在抗血管生成和抑制细胞增殖作用的基因，逐渐受到研究者的关注。已有研究表明，arresten基因在多种疾病模型中能够发挥抑制异常细胞增殖和血管生成的作用，这使其成为抑制静脉内膜增生的潜在候选基因。

纳米粒作为基因转染的载体，具有靶向性好、生物相容性高、转染效率较高等优势。利用纳米粒介导基因转染，能够提高基因在靶细胞中的表达效率，减少对正常细胞的影响，为arresten基因在抑制兔移植静脉内膜增生中的应用提供了可行的途径。基于此，本研究旨在探讨纳米粒介导人arresten基因转染对兔移植静脉内膜增生的抑制作用。

二、实验材料与方法

（一）实验动物

选取健康成年新西兰大白兔40只，雌雄不限，体重2.5-3.0kg，由正规实验动物中心提供，实验前适应性喂养1周。

（二）主要材料与试剂

人arresten基因重组质粒由本实验室构建并保存；纳米粒载体购自某生物科技公司；反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）相关试剂、Westernblot相关试剂、免疫组织化学染色试剂盒等均购自知名试剂供应商；手术器械为常规外科手术器械。

（三）实验分组

将40只新西兰大白兔随机分为4组，每组10只，分别为：

空白对照组：仅进行静脉移植手术，不做其他处理。

空载体组：在静脉移植手术中，给予纳米粒空载体处理。

单纯arresten基因组：在静脉移植手术中，直接给予人arresten基因溶液处理。

纳米粒介导arresten基因组：在静脉移植手术中，给予纳米粒介导的人arresten基因转染处理。

（四）实验方法

兔移植静脉模型建立：采用常规手术方法，将兔耳中央静脉段移植到颈外静脉处，建立兔移植静脉模型。

基因转染：在移植手术过程中，按照各组实验设计，分别对移植静脉进行相应的处理。纳米粒介导arresten基因组将人arresten基因与纳米粒载体按照一定比例混合，制备成纳米粒-基因复合物，通过局部注射的方式导入移植静脉。

样本采集：分别在术后1周、2周、4周，每组随机选取3只兔，麻醉后取材，采集移植静脉组织。

检测指标及方法

内膜厚度测量：将采集的移植静脉组织进行石蜡包埋、切片，HE染色后，在光学显微镜下观察，采用图像分析软件测量内膜厚度。

arresten基因mRNA表达检测：采用RT-PCR法，提取移植静脉组织总RNA，反转录合成cDNA，进行PCR扩增，以β-actin为内参，检测arresten基因mRNA的表达水平。

arresten蛋白表达检测：采用Westernblot法，提取移植静脉组织总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，用arresten蛋白特异性抗体进行孵育，显色后，采用图像分析软件分析蛋白表达水平。

细胞增殖检测：采用免疫组织化学染色法，检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，计数PCNA阳性细胞率，评估细胞增殖情况。

三、实验结果

（一）内膜厚度变化

术后1周、2周、4周，空白对照组和空载体组移植静脉内膜厚度逐渐增加，且两组之间无显著差异（P0.05）。单纯arresten基因组内膜厚度较空白对照组和空载体组有所减少，但差异不显著（P0.05）。纳米粒介导arresten基因组内膜厚度在各时间点均显著低于其他三组（P0.05），且随着时间的推移，内膜厚度增加缓慢（见表1）。

组别

术后1周（μm）

术后2周（μm）

术后4周（μm）

空白对照组

45.2±5.1

82.3±7.5

125.6±9.8

空载体组

46.1±4.8

83.5±6.9

126.3±10.2

单纯arresten基因组

40.3±4.5

70.2±6.2

105.8±8.5

纳米粒介导arresten基因组

30.1±3.2

45.6±4.8

68.5±5.6

（二）arresten基因mRNA表达

RT-PCR结果显示，术后各时间点，空白对照组和空载体组几乎无arresten基因mRNA表达。单纯arresten基因组有少量arresten基因mRNA表达，且随着时间的推移表达量逐渐降低。纳米粒介导arresten基因组arresten基因mRNA表达水平在各时间点均显著高于单