枯草芽孢杆菌穿梭表达载体和表面展示载体的构建.docVIP

枯草芽孢杆菌穿梭表达载体和表面展示载体的构建

枯草芽孢杆菌穿梭表达载体的构建

1.载体设计的基本元件

-复制起始位点：需要包含能在枯草芽孢杆菌中有效复制的起始位点，如pUB110、pE194等质粒的复制起始区。这些起始位点可确保载体在枯草芽孢杆菌细胞内稳定复制，维持一定的拷贝数。同时，还需有能在大肠杆菌中复制的起始位点，以便在大肠杆菌中进行克隆操作和大量扩增载体，常用的如pBR322或pUC系列的复制起始位点。

-选择标记：通常要设置两个选择标记，一个用于大肠杆菌筛选，如氨苄青霉素抗性基因（ampR），另一个用于枯草芽孢杆菌筛选，如氯霉素抗性基因（cat）、卡那霉素抗性基因（kanR）等。通过在含有相应抗生素的培养基上培养，可以筛选出含有重组载体的细胞。

-多克隆位点：在载体上设计一段包含多个限制性内切酶识别位点的区域，即多克隆位点（MCS）。这方便将外源基因片段准确地插入到载体中，不同的酶切位点可以用于不同基因的克隆以及后续的亚克隆操作。

-启动子：要选择适合枯草芽孢杆菌的强启动子，例如枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子（Pamy）、木糖诱导型启动子（Pxyl）等。启动子能够驱动外源基因在枯草芽孢杆菌中的转录，不同的启动子具有不同的表达特性，可根据实际需求选择组成型或诱导型启动子。

-终止子：在基因表达盒的下游需要添加转录终止子，如rrnB核糖体RNA操纵子的终止子（T1T2）等。终止子可以有效终止转录过程，防止转录通读，保证外源基因转录的准确性和稳定性。

2.构建步骤

-基因元件获取：通过PCR技术从已知的质粒或基因组DNA中扩增出上述所需的各个元件，如复制起始位点、选择标记基因、启动子、终止子等。对于多克隆位点，可以通过化学合成含有多个酶切位点的寡核苷酸片段，然后通过连接反应将其整合到载体骨架中。

-载体骨架构建：选择合适的基础载体，一般是大肠杆菌的质粒载体，如pUC19等。用限制性内切酶切割载体，去除不必要的片段，并保留合适的酶切位点以便后续连接其他元件。

-元件组装：利用DNA连接酶将扩增得到的各个元件按照设计好的顺序依次连接到载体骨架上。可以采用分步连接的方法，先连接重要的功能元件，如复制起始位点、选择标记等，构建初步的载体框架，然后再连接启动子、多克隆位点和终止子等部分，逐步完成穿梭表达载体的构建。

-转化与筛选：将构建好的载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过在含有相应抗生素（如氨苄青霉素）的培养基上筛选出含有重组载体的大肠杆菌克隆。对筛选得到的克隆进行质粒提取和酶切鉴定，验证载体构建是否正确。然后将验证正确的载体转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，在含有适用于枯草芽孢杆菌的抗生素（如氯霉素）的培养基上筛选转化子。同样对枯草芽孢杆菌转化子进行进一步的验证，如PCR鉴定、测序等，确保载体在枯草芽孢杆菌中也能正常存在和发挥功能。

枯草芽孢杆菌表面展示载体的构建

1.载体设计特点

-信号肽序列：表面展示载体需要包含一段信号肽序列，通常来自枯草芽孢杆菌自身分泌蛋白的基因，如AprE（碱性蛋白酶）、NprE（中性蛋白酶）等蛋白的信号肽。信号肽能够引导融合蛋白穿过细胞膜，进入细胞周质空间或分泌到细胞外环境，为后续展示到细胞表面奠定基础。

-锚定蛋白或结构域：选择合适的锚定蛋白或结构域是表面展示载体的关键。常见的有枯草芽孢杆菌细胞壁结合蛋白（如LytC、YwbN等）的C末端结构域，这些结构域能够与细胞壁成分（如肽聚糖）特异性结合，将融合蛋白稳定地锚定在细胞表面。

-外源蛋白融合位点：在载体上要设计合适的位点用于插入外源蛋白基因。一般位于信号肽序列和锚定结构域之间，通过基因融合的方式使外源蛋白与信号肽和锚定结构域相连，形成融合蛋白，从而实现外源蛋白在枯草芽孢杆菌表面的展示。

-其他元件：与穿梭表达载体类似，表面展示载体也需要包含复制起始位点、选择标记、启动子和终止子等元件，以确保载体在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的复制、筛选以及外源基因的有效转录和表达。

2.构建步骤

-元件准备：通过PCR从枯草芽孢杆菌基因组或相关质粒中扩增出信号肽序列、锚定蛋白结构域等元件。同时，准备好待展示的外源蛋白基因片段，可从相应的基因文库或通过PCR扩增获得。

-载体骨架改造：选择合适的基础载体，一般也是以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为基础。对载体进行酶切处理，去除不相关的片段，并引入用于连接信号肽、外源蛋白基因和锚定结构域的酶切位点。

-融合基因构建：将信号肽序列、外源蛋白基因和锚定结构域按照顺序依次连接，构建融合基因。可以采用重叠延伸PCR等技术先将这些片段拼接成完整的