毕赤酵母内源信号肽的筛选及头孢菌素c酰化酶的分泌表达.docVIP

毕赤酵母内源信号肽的筛选及头孢菌素c酰化酶的分泌表达

一、毕赤酵母内源信号肽筛选的意义

毕赤酵母作为一种常用的真核表达系统，在分泌表达异源蛋白方面具有诸多优势。信号肽在引导蛋白质跨膜转运和分泌过程中起着关键作用。筛选合适的毕赤酵母内源信号肽，能够有效提高目标蛋白（如头孢菌素C酰化酶）的分泌效率，增强其表达量，同时有助于保证蛋白正确折叠和功能活性。

二、毕赤酵母内源信号肽筛选的方法

1.数据库检索与分析

-首先从毕赤酵母的基因组数据库中查找已知具有信号肽功能的基因序列。这些基因通常编码一些在毕赤酵母正常生理活动中分泌到胞外的蛋白质，如醇氧化酶（AOX）、酸性磷酸酶（PHO1）等相关基因的信号肽区域。

-利用生物信息学工具对这些潜在信号肽的氨基酸序列进行分析，预测其信号肽特征，包括信号肽长度、疏水区分布、切割位点等。例如，通过SignalP等软件进行信号肽预测和分析。

2.构建信号肽文库

-以毕赤酵母基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增出包含不同潜在内源信号肽的基因片段。设计引物时，要确保准确扩增出完整的信号肽编码序列，并在两端添加合适的酶切位点，便于后续克隆操作。

-将扩增得到的信号肽片段分别克隆到合适的载体上，构建信号肽文库。常用的载体有pPICZαA等，该载体带有筛选标记和启动子等元件，可用于后续在毕赤酵母中的表达。

3.筛选与评估

-将构建好的信号肽文库转化到毕赤酵母感受态细胞中，通过筛选标记（如抗生素抗性）筛选出成功转化的菌株。

-选择一个报告基因（如绿色荧光蛋白GFP或分泌型碱性磷酸酶SEAP），将其与不同信号肽进行融合表达。通过检测报告基因的分泌情况和活性，初步评估各个信号肽的引导分泌能力。例如，对于GFP融合蛋白，可以通过荧光显微镜观察或流式细胞仪检测细胞内外的荧光强度，判断信号肽是否能有效引导GFP分泌到胞外；对于SEAP融合蛋白，可以通过酶活性检测试剂盒测定其在培养液中的活性。

-对初步筛选出的具有较好引导分泌能力的信号肽，进一步与目标蛋白（头孢菌素C酰化酶）进行融合表达。通过SDS、Westernblotting等方法分析头孢菌素C酰化酶的表达量和分泌情况，同时检测其酶活性，最终确定最适合头孢菌素C酰化酶分泌表达的毕赤酵母内源信号肽。

三、头孢菌素C酰化酶的分泌表达

1.表达载体构建

-将筛选得到的最佳内源信号肽与头孢菌素C酰化酶基因进行融合，构建重组表达载体。一般是将融合基因克隆到毕赤酵母表达载体上，如pPIC9K等。载体上除了包含信号肽-目的基因融合片段外，还需要有合适的启动子（如AOX1启动子）、终止子、筛选标记（如Zeocin抗性基因）等元件。

-通过限制性内切酶酶切和连接反应，将融合基因准确插入到载体相应位置，构建重组表达载体，并进行测序验证，确保基因序列正确，信号肽与头孢菌素C酰化酶基因连接无误。

2.转化毕赤酵母

-将构建好的重组表达载体线性化处理，然后采用电击转化或化学转化等方法将其导入毕赤酵母感受态细胞中。电击转化时，需设置合适的电压、电容等参数，以提高转化效率。

-转化后的细胞涂布在含有相应抗生素（如Zeocin）的平板上，筛选出阳性转化子。通过菌落PCR或质粒提取酶切验证等方法进一步确认转化子中是否含有正确的重组表达载体。

3.诱导表达与优化

-将筛选得到的阳性转化子接种到合适的培养基（如BMGY培养基）中，在合适的温度（通常28-30℃）和摇床转速（如200-250rpm）条件下进行培养，使细胞生长至对数生长期。

-然后将细胞转接至BMMY培养基中，添加甲醇进行诱导表达。甲醇作为诱导剂，能够启动AOX1启动子，从而促进头孢菌素C酰化酶的表达。在诱导表达过程中，需要优化诱导条件，如甲醇添加浓度、诱导时间、诱导温度等，以提高头孢菌素C酰化酶的分泌表达量。可以通过设置不同的甲醇浓度梯度（如0.5%、1%、2%等）和诱导时间点（如24h、48h、72h等），检测发酵液中头孢菌素C酰化酶的酶活性和蛋白含量，确定最佳诱导条件。

4.蛋白纯化与分析

-诱导表达结束后，收集发酵液。首先通过离心等方法去除细胞碎片，然后采用合适的蛋白纯化方法对头孢菌素C酰化酶进行纯化。常用的纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱等。例如，可以利用头孢菌素C酰化酶与底物或特异性抗体的亲和性，采用亲和色谱柱进行纯化。

-对纯化后的头孢菌素C酰化酶进行分析，包括SDS-PAGE分析其分子量和纯度，West