色谱技术及应用课件.pptVIP

***問題：1、珍珠港事件----蛋白流失，感染2、急性腎炎----蛋白流失*乙醇的滲透蒸發分離，選用帶-COOH的膜，有利於分離除水（H2O與-COOH形成氫鍵）色譜技術及應用1 凝膠過濾技術1)、Gelfiltrationchromatography(GFC)原理操作與原理：含有不同組分的溶液，通過網狀結構的凝膠粒子(a)，小分子擴散進入凝膠相，大分子被排阻於凝膠相外，加入洗脫劑後溶液向下推移，大分子及剩餘的小分子進入下層新的凝膠相中，重複上述擴散和排阻。這樣最先流出的為最大的分子，最後流出的為最小分子，分段收集可以獲得按分子量大小分佈的各組分。分子篩色譜:從上可見，凝膠過濾具有分子篩的作用。分離關係：組分0的M最大，不能進入gel，洗脫體積為空隙體積V0；組分t的M最小，能進入到gel的細孔中，其洗脫體積接近柱體積Vt,組分1-2在V0-Vt之間.顯然，GFC能分離洗脫體積在V0-Vt之間的組分。對於組分1和2，兩峰距離m1 凝膠過濾技術分配係數m影響因素：分子量,分子形狀,gel孔徑結構；與pH,I,T無關.2)、凝膠介質對介質的要求：1st 親水性高；2nd 表面惰性，不發生化學和物理變化；3rd 高穩定性，有較寬的pH和I適應範圍；4th 具有一定的孔徑分佈；5th 機械強度高，耐高壓操作，壽命長。 商品化的介質均能滿足1-4條的要求。介質的類型：1st Sephadex2nd Sephacryl3rd Superose/-dex,Sepharose4th Cellulose5th TSKgel1 凝膠過濾技術3)、凝膠介質特徵參數排阻極限(exclusionlimit)：指不能擴散到凝膠網路內部的最小分子的M。如，SephadexG50的排阻極限為30kD。分級範圍(fractionationrange)：能阻滯組分並且使組分相互之間得到分離的組分分子量範圍。如，SephadexG50的分級在1.5-30KD內。溶脹率/吸水率： 如，SephadexG50的溶脹率=500±30%。 意義:凝膠粒徑：軟gel粒徑較大，在50-150?m之間；硬gel較小，在5-50?m之間。粒徑越小，HETP越小，分離效率越高。床體積(bedvolume)：1g乾燥gel溶脹後所佔有的體積。如，SephadexG50的床體積為9-11cm3/g幹膠。空隙體積(voidvolume)：凝膠之間的空隙體積，即V0。 空隙體積一般用平均分子量在2000KD水溶性藍葡聚糖(bluedextran)測定。1 凝膠過濾技術4)、影響因素線速度：1stHW40F凝膠的排阻極限小，在該凝膠中蛋白質的m=0，故HETP=2Dz/u(Dz?udp)=常數。2ndHW55F凝膠的排阻極限較大，在此，m0,HETP?u;在u=0處，直線交於點2Dz/u。3rd當u0.2cm/min,NaCl的HETP隨流速降低急劇增大。這主要由於分子的擴散影響。進樣體積：1st在一定相對料液體積範圍內，HETP為常數；2nd但，之後，HETP隨料液相對體積的增加而急劇增大。3rd意義：為得到較高的分離度，料液體積需根據溶質的m差別控制在適當的範圍內，在不影響分離度的前提下取最大值。料液濃度 依據GFC的原理，tr和HETP與濃度無關。但實驗表明，當濃度較高時，洗脫曲線出現吐舌、拖尾、甚至雙峰；使HETP極度上升。這主要為樣品黏度高造成。經驗表明，料液與流動相的黏度比應控制在2以內。1 凝膠過濾技術分子量M和分配係數m1st在GFC分級範圍內m與M關係 此時，分離度方程為 方程示：b值越大，即凝膠分級範圍越小，Rs越大。2nd因此，一定料液時，根據組分的M選擇分級範圍較小的介質，提高Rs和料液的處理量。凝膠的粒徑1stdp?,HETP?.故dp?是N?的最佳途徑；2nddp?10倍,而h和v不變，u?10倍，HETP(=hdp)?10倍，R?10倍1 凝膠過濾技術5）、應用1st分離純化 M：x0-106， d:0.x-x00nm之間； 種類：肽、脂質、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd除熱原、過敏原 如青黴噻唑蛋白–SephadexG25凝膠柱。3rd 脫鹽/置換buffer1 凝膠過濾技術4thM測定 原理： 挑選標準蛋白質：cytC(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋