色谱分离技术课件.pptVIP

（3）矽膠的活化活化矽膠常採用矽烷化試劑，如γ-氨丙基三甲（乙）氧矽烷和環氧丙基三甲基矽烷等，反應為：引入活性氨基或環氧基後，在酸性溶液中環氧基可發生二醇化反應：（四）間隔臂當配基較小時，將其直接固定在載體上，會由於載體的空間位阻，配基大分子不能發生有效的親和吸附作用。這時，需要在配基與載體之間連接一個“間隔臂”，使其發生有效的親和結合。間隔臂的作用間隔臂應滿足以下條件：發生作用的活性位點必須位於配基分子的內部，並且不能影響配基與目標產物結合；長度適當，不能過短，否則難以和配基有效結合，不能太長，以免自身某些基團發生相互作用，同時結合能力下降；必須在某種特定的分離條件下能被洗脫（五）封閉活化結束後有少部分活化基團未被配基偶聯，需要將其封閉。可加入過量的能與活化劑反應的試劑封閉多餘的活化基團，或水解活化基團。五、親和色譜法的操作過程1.配基固相化（樣品製備、裝柱、平衡）2.親和吸附3.解吸附4.色譜柱再生1.配基固定化。將與純化對象有專一結合作用的物質，連接在水不溶性載體上，製成親和吸附劑後裝柱（稱親和柱）。2.親和吸附（進料和雜質清洗）。將含有純化對象的混合物通過親和柱，純化對象吸附在柱上，其他物質流出色譜柱。3.解吸附（目標產物洗脫）。用某種緩衝液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質洗脫出來。4.色譜柱再生。清洗液清洗。（一）樣品製備（二）裝柱與平衡（三）吸附：被分離的目標產物與親和吸附介質緊密結合的過程（四）清洗：洗去色譜柱中和吸附劑內部未被吸附的雜質，盡可能留下專一性吸附的結合物。（五）洗脫1、洗脫方法特異性洗脫：用能與配基可待分離物質發生更強特異性親和作用的小分子化合物作為洗脫劑，通過與配基可目標產物竟爭性結合，使配基與目標產物解吸的洗脫方式。特異性洗脫通常在低濃度、中性pH下，條件溫和，有利於目標產物的活性。同時有利於提高目標產物的純度。例如：Lys和Arg均為t-PA（組織纖溶酶原啟動劑）的抑制劑，利用固定化Lys為配基親和分離t-PA時，可用Arg溶液進行洗脫。非特異性洗脫：改變洗脫液的pH、離子強度、離子種類或溫度等物化性質，降低目標產物與配基之間親和作用的洗脫方法。比如：目標產物與配基通過靜電作用時，可提高離子強度法洗脫。2、洗脫方式一步洗脫：針對目標產物與配基高度特異性結合的情況。調節洗脫液的性質，以改變目標產物與配基之間的結合作用，將目標產物一次性洗脫下來，可得到較純的分離物。分步洗脫：親和配基的專一性結合作用較弱，配基上結合了包括目標產物在內的一組結構相似的物質，需要幾中不同的洗脫條件分幾步洗脫。即先用解吸附作用弱的洗脫液，再用解吸附作用強的洗脫液。可將親和力不同的成分從配基上分別洗脫下來。梯度洗脫：利用洗脫液的pH、離子強度等因素的梯度變化，將吸附性質相同、特異性程度不同的物質洗脫下來。隨著洗脫液解吸附能力的逐漸增強，與配基親和力不同的被吸附物質分別被洗脫下來。效果比分步洗脫要好。（六）親和色譜介質的再生與保存1、再生去除未被洗脫的仍然結合在親和介質上的物質，以使親和柱能反復使用。2、保存親和色譜介質一般保存於溶脹狀態，溫度4℃-8℃,可加入乙醇或疊氮鈉。三、離子交換劑的理化性能（一）離子交換樹脂的理化性能1、物理性質外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為16-60目;孔度、孔徑、比表面積機械強度：90%；含水量：0.3-0.7g/g樹脂；穩定性：熱穩定性；膨脹度：交聯度、活性基團的性質與數量、活性離子的性質、介質的性質和濃度、骨架結構；濕真密度：單位體積濕樹脂的重量；2、交換容量總交換量：每單位數量樹脂能進行離子交換反應的化學基團的總量。工作交換容量：樹脂在某一條件下的離子交換能力。再生交換容量：一定的再生劑量條件下所取得的再生樹脂的交換容量。再生交換容量為總交換容量的50-90%，工作交換容量為再生交換容量的30-90%。3、吸附選擇性對陽離子的吸附對陰離子的吸附對有色物的吸附（二）多糖基離子交換劑的理化性能極大的表面積和多孔結構良好的化學、物理穩定性離子交換纖維素適於易變性的生化產品的純化分離能力強，能將一組複雜的混合物逐一分開能分離純化毫克量的純品四、離子交換色譜基本操作（一）離子交換樹脂的操作1、離子交換樹脂的選擇對陰陽離子交換樹脂，一般根據被分離物質所帶的電荷來決定選用哪種樹脂。被分離物質帶正電荷，則採用陽離子交換樹脂，被分離物質帶負電荷，則採用陰離子交換樹脂。2、對離子交換樹脂強弱的選擇目標產物具有較強的鹼性和酸性時，宜選用弱酸或弱鹼性的樹脂，以提高選擇性，並便於洗脫。目標產物是弱酸或