色谱技术课件.pptVIP

常用的離子交換樹脂葡聚糖凝膠型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纖維素系列離子交換劑DEAE-SephacelCellex系列瓊脂糖系列離子交換劑Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseBio-GelA系列交聯瓊脂糖離子交換劑ExpandedBed分子篩凝膠色譜在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由於流經體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離優點： 操作簡便 分離效果好，重複性高，回收率高 分離條件溫和 應用廣泛適用於生物大分子的初級分離，脫鹽 解析度低分子篩凝膠色譜原理出柱順序：按分子由大到小順序先後流出並得到分離。常用的溶劑：①鹼性水溶液（0.1mol/LNH4OH）含鹽水溶液（0.5mol/LNaCl等）②醇及含水醇，如甲醇、甲醇—水③其他溶劑：如含水丙酮，甲醇-氯仿Desaltingproteinsproteinssalts凝膠色譜填料葡聚糖凝膠SephadexG-系列聚丙烯醯胺凝膠 Sephacryl系列瓊脂糖凝膠Sepharose系列Superose系列疏水作用層析

根據疏水作用分離生物大分子MechanismofHIC親和色譜（Affinitychromatography）載體活化、配基連接、吸附、洗脫Competitiveelution蛋白質分離常用的色譜方法免疫親和層析 屬於吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強的吸附力，實現特殊蛋白質的分離免疫親和層析介質的獲得：（1）獲得抗體（2）抗體連接到載體上色譜技術

色譜技術（分配色譜）概念：色譜技術是一組相關分離方法的總稱，色譜柱的一般結構含有固定相（多孔介質）和流動相，根據物質在兩相間的分配行為不同（由於親和力差異），經過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達到分離的目的。色譜分離方法的分類色譜分離方法很多，種類有四、五十種但常用於生物大分子分離的色譜方法，按機理分，有以下幾種：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜色譜系統的基本組成色譜分離的基本概念分配係數可由Langmuir方程得出Kd---分配係數q、c---溶質在固相和液相中的濃度保留時間（tR）和保留體積（VR）反應樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學參數之一阻滯因數Rt阻滯因數是在色譜系統中溶質的移動速度和標準物（與固定相沒有親和力的流動相Kd=0）的遷移率之比其意義在於體現某一種溶質與固定相之間的親和力大小洗脫體積色譜柱中，使溶質從柱中流出所需流動相體積，為洗脫體積不同的溶質，由於和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異色譜柱的理論塔板數、塔板高度反應不同時刻溶質在色譜柱中的分佈以及分離度與柱高之間的關係理論塔板數的計算方法：N---理論塔板數tR---保留時間W1/2---半峰寬Wb---峰底寬度理論塔板高度：L---柱長吸附色譜原理:利用溶質與吸附劑之間的分子吸附力(範德華力，包括色散力、誘導力、定向力以及氫鍵)的差異而實現分離關鍵要素：吸附劑和展開劑的選擇吸附劑：氧化鋁、矽膠、聚醯胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團，如-OH和-NH2吸附色譜常用的吸附劑：氧化鋁矽膠活性炭纖維素聚醯胺矽藻土物理吸附基本規律（2）被分離的物質與吸附劑、洗脫劑共同構成吸附過程中的三要素，彼此緊密相連。（1）物理吸附過程一般無選擇性，但吸附強弱大體遵循“相似者易於吸附”的經驗規律。矽膠、氧化鋁因均為極性吸附劑,故有以下特點:(1)對極性物質具有較強的親和能力,極性強的溶質將被優先吸附。(2)溶劑極性越弱,則吸附劑對溶質將表現出較強的吸附能力。溶劑極性增強,則吸附劑對溶質的吸附能力即隨之減弱。 (3)溶質即使被矽膠、氧化鋁吸附,但一旦加入極性較強的溶劑時,又可被後者置換洗脫下來。活性炭因為是非極性吸附劑,故與矽膠、氧化鋁相反,對非極性物質具有較強的親和能力,在水中對溶質表現出強的吸附能力。溶劑極性降低,則活性炭對溶質的吸附能力也隨之降低。故從活性炭上洗脫被吸附物質時,洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的降低而增強。極性及其強弱判斷極性強弱是支配物理吸附過程的主要因素。所謂極性乃是一種抽象概念,用以表示分子中電荷不對稱(asymmetry)的程度，並大體上與偶極矩(d