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聚乙烯亚胺基siRNA载体的制备及抗肿瘤作用研究

一、研究背景

在当今医学领域，肿瘤的治疗一直是亟待攻克的难题。传统的肿瘤治疗方法，如化疗、放疗等，虽然在一定程度上能够抑制肿瘤细胞的生长，但往往伴随着严重的副作用，对患者的身体造成极大的伤害。随着基因治疗技术的不断发展，小干扰RNA（siRNA）因其能够特异性地沉默肿瘤相关基因，为肿瘤治疗带来了新的希望。然而，siRNA在体内易被降解，且难以穿过细胞膜进入靶细胞，这极大地限制了其临床应用。

聚乙烯亚胺（PEI）作为一种阳离子聚合物，具有良好的水溶性和生物相容性，能够通过静电相互作用与siRNA结合形成复合物，有效保护siRNA不被降解，并促进其进入细胞。因此，聚乙烯亚胺基siRNA载体成为了当前肿瘤基因治疗研究的热点之一。但同时，PEI也存在一些缺陷，如较高的细胞毒性等，需要对其进行修饰和优化，以提高其安全性和靶向性。

二、聚乙烯亚胺基siRNA载体的制备

（一）材料与试剂

本次实验所用的主要材料和试剂包括：聚乙烯亚胺（分子量分别为25kDa、10kDa）、siRNA（针对肿瘤相关基因，如Survivin、Bcl-2等）、修饰剂（如聚乙二醇、靶向肽等）、溶剂（蒸馏水、乙醇等）以及各种化学试剂（如EDC、NHS等）。所有材料和试剂均购自正规厂家，并经过严格的质量检测。

（二）制备方法

PEI的修饰：采用化学偶联法对PEI进行修饰。将一定量的PEI溶解在适量的溶剂中，加入修饰剂和催化剂（如EDC、NHS），在一定的温度和反应时间下进行反应。反应结束后，通过透析、离心等方法纯化产物，得到修饰后的PEI。

siRNA与PEI的复合：将修饰后的PEI和siRNA分别溶解在缓冲液中，按照一定的N/P比例（氮原子与磷原子的比例）将两者混合，在室温下孵育一定时间，形成聚乙烯亚胺基siRNA载体复合物。

三、聚乙烯亚胺基siRNA载体的表征

（一）粒径和zeta电位测定

使用动态光散射仪（DLS）测定载体复合物的粒径和zeta电位。结果显示，所制备的载体复合物粒径分布均匀，平均粒径在100-200nm之间，zeta电位为正值，这有利于其与带负电的细胞膜相互作用，促进细胞内化。

（二）形态观察

通过透射电子显微镜（TEM）观察载体复合物的形态。可见载体复合物呈球形或类球形，分散性良好，无明显聚集现象。

（三）siRNA结合能力测定

采用琼脂糖凝胶电泳实验检测PEI与siRNA的结合能力。结果表明，当N/P比例达到一定值时，PEI能够完全结合siRNA，阻止其在凝胶中迁移，说明载体具有良好的siRNA结合能力。

（四）稳定性考察

将载体复合物置于不同的环境条件下（如不同pH值、血清浓度等），测定其粒径和siRNA释放情况。结果显示，载体复合物在生理条件下具有较好的稳定性，能够缓慢释放siRNA。

四、聚乙烯亚胺基siRNA载体的体外抗肿瘤作用研究

（一）细胞毒性实验

采用MTT法检测载体复合物对肿瘤细胞（如肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7等）和正常细胞（如人脐静脉内皮细胞HUVEC）的毒性。结果表明，修饰后的PEI载体复合物对正常细胞的毒性较低，而对肿瘤细胞具有一定的选择性毒性，且随着载体浓度的增加，毒性逐渐增强。

（二）细胞内化实验

利用荧光标记的siRNA和PEI，通过荧光显微镜观察载体复合物在肿瘤细胞内的内化情况。结果显示，载体复合物能够有效地被肿瘤细胞内化，并且在细胞内释放siRNA。

（三）基因沉默效率测定

采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot实验检测siRNA对肿瘤相关基因的沉默效率。结果表明，聚乙烯亚胺基siRNA载体能够高效地将siRNA递送至肿瘤细胞内，显著下调靶基因的mRNA和蛋白表达水平，沉默效率可达70%以上。

（四）细胞凋亡实验

通过流式细胞术检测载体复合物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。结果显示，与对照组相比，载体复合物处理后的肿瘤细胞凋亡率明显升高，说明其能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡。

五、聚乙烯亚胺基siRNA载体的体内抗肿瘤作用研究

（一）动物模型建立

建立裸鼠移植瘤模型，将人肿瘤细胞（如HepG2、MCF-7等）接种于裸鼠皮下，待肿瘤生长至一定体积后进行实验。

（二）体内分布实验

采用荧光标记的载体复合物，通过活体成像技术观察其在裸鼠体内的分布情况。结果显示，载体复合物能够靶向聚集于肿瘤部位，在其他组织中的分布较少，说明其具有良好的肿瘤靶向性。

（三）抑瘤效果评价

将裸鼠随机分为对照组（生理盐水）、单纯siRNA组、未修饰PEI