第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合.pptVIP

第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合演示文稿;优选第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合;二、原生质体诱变育种

菌种活化和与培养→原生质体制备→原生质

体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌

平皿中→紫外灯下诱变处理→置暗处后处

理→再生培养→高产菌株分离→复筛→遗传

性状鉴定→菌种特性和发酵特性研究;三、原生质体转化育种

菌种活化和与培养→原生质体制备→离心洗

涤，取原生质体悬浮液1ml，2倍SMM浓缩液和

质粒DNA各0.1ml，然后加入40%聚乙二醇

4000ml，混匀后静置2min,离心，悬浮于

1mlHCP培养几种，适当稀释后分离在选择培

养基上，双层平板培养，筛选转化子。;第二节微生物原生质体融合育种;基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为同核

体，来自不同基因型的融合细胞则称为异核体。

从融合效果上，细胞融合包括：

对称融合：即两个完整的细胞间的融合。

不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。

;二、发展历史;1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。

20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。

细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞伴随者细胞融合技术的成熟。

20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了，细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。

;三、原生质体融合育种的特点;4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。

5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。

6)提高菌株产量的潜力较大。

7)有助于建立工业微生物转化体系。

;四、细胞融合过程;融合过程中细胞膜变化;五、原生质体融合技术;（一）微生物原生质体制备;2、微生物细胞壁组成;真核细胞壁组成;3、制备原生质体的酶类;4、影响原生质体制备的因素;3)酶浓度

对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，对酶的浓度也有差异。最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。

酶浓度合适，浓度太高对原生质体有破坏作用，???响原生质体的再生

4)酶处理温度:根据具体情况,细菌高,酵母及霉菌稍低。过高的温度使酶失活，原生质体失活；过低的温度酶活性不高，影响原生质体细胞膜稳定性;5)破壁时的pH值:对离子强度影响较大

6)渗透压稳定剂

等渗透压在原生质体制备中起到保护原生质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。;5、原生质体制备程序;原生质体的保存;影响原生质体存活的遗传因素;（二）原生质体融合;2、原生质体融合的方法;(1)物理法——电融合诱导法;具体步骤;第二十八页，共五十页。;DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细胞核的位置。;第三十页，共五十页。;第三十一页，共五十页。;;;特点;(2)生物法;原理与过程;特点;(3)化学法;高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导;;(4)方法选择;（三）融合体的再生;4）加入再生细胞壁诱导物及前体物质

在培养基中加入明胶、细胞壁残片甚至席位苏滤膜都有刺激原生质体再生的功能。

2、再生培养温度

过高温度对原生质体再生有一只作用，当再生温度略低于菌株培养温度时，有利于原生质体的再生

3、操作方式涂布培养法对原生质体有损坏;4、固体培养

一般认为固体培养优于液体培养。液体培养时细胞壁可溶性物质很容易扩散（如酵母在液体再生液中很难再生）；

固体培养基限制有效分子的扩散，但先在液体培养基中预培养2-3小时有利于提高再生率。

;（四）融合细胞筛选;1、筛选的原因与必要性;2、杂种细胞筛选方法;例子：利用抗性标记进行的融合细胞筛选;;谢谢大家！