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园艺植物无菌组织培养操作手册

前言

园艺植物无菌组织培养（以下简称“组培”）是一项基于植物细胞全能性理论，在无菌条件下，将植物离体的器官、组织、细胞或原生质体等外植体，接种到人工配制的培养基上，给予适宜的环境条件，使其诱导形成愈伤组织、不定芽、不定根，最终发育成完整植株的技术。这项技术不仅是植物快速繁殖、脱毒苗培育、新品种选育的重要手段，也是植物生理学、分子生物学等基础研究的关键技术平台。本手册旨在为从事园艺植物组织培养的科研人员、技术人员及相关爱好者提供一套系统、严谨、实用的操作指南，以期规范操作流程，提高培养成功率。

一、准备工作

1.1实验室设计与主要设备

组织培养实验室应根据工作需要合理规划，通常包括准备室、接种室、培养室等功能区域。各区域应保持相对独立，以减少交叉污染。

*准备室：用于培养基的配制、分装、灭菌，以及玻璃器皿的清洗、干燥和储存。主要设备包括：冰箱、天平（精确到0.001g和0.1g）、pH计、磁力搅拌器、微波炉或电炉、蒸馏水器或超纯水机、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、玻璃器皿柜等。

*接种室：核心区域，用于外植体的消毒、接种及培养物的继代转移等无菌操作。要求密闭性好，定期消毒。主要设备为超净工作台，可配备紫外灯、臭氧发生器等空气消毒设备。

*培养室：用于培养物的培养和生长。需能精确控制温度、光照和湿度。主要设备包括：培养架、光照培养箱或人工气候箱、恒温恒湿培养室、空调、除湿机/加湿器等。

1.2实验材料与试剂

*植物材料：选择生长健壮、无病虫害的优良母株。根据培养目的选择合适的外植体，如茎尖、茎段、叶片、花药、胚等。

*化学试剂：

*大量元素：如硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙等。

*微量元素：如硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠等。

*有机物质：如肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇（VB6）、盐酸硫胺素（VB1）、甘氨酸等。

*植物生长调节剂：如生长素类（吲哚乙酸IAA、萘乙酸NAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D）、细胞分裂素类（6-苄基腺嘌呤6-BA、激动素KT、玉米素ZT）、赤霉素（GA3）等。

*碳源：常用蔗糖，也可使用葡萄糖、果糖等。

*凝固剂：常用琼脂，根据需要选择不同凝固强度的琼脂。

*其他添加物：如活性炭、水解酪蛋白、椰乳、抗生素等，根据培养需求添加。

*消毒剂：如次氯酸钠、升汞（氯化汞，剧毒，慎用）、过氧化氢、酒精等。

*酸碱调节剂：如盐酸、氢氧化钠。

1.3玻璃器皿与工具

*玻璃器皿：培养瓶（三角瓶、广口瓶、试管等）、烧杯、量筒、容量瓶、移液管、试剂瓶、漏斗等。

*金属工具：手术刀、手术剪、镊子（直头、弯头）、接种针、解剖针等。

*其他：酒精灯、记号笔、封口膜（或棉塞、透气膜）、滤膜（用于过滤除菌的试剂）、微孔滤膜过滤器等。

所有玻璃器皿和金属工具在使用前必须经过严格清洗和灭菌处理。清洗时先用自来水冲洗，再用合适的洗涤剂浸泡、刷洗，最后用蒸馏水或去离子水润洗2-3次，干燥后备用。

二、培养基的制备

2.1母液的配制与保存

为提高培养基配制效率和准确性，通常将培养基中的各种成分按一定倍数配制成浓缩液，即母液。

*母液种类：一般分为大量元素母液（通常稀释10-20倍）、微量元素母液（通常稀释____倍）、铁盐母液（通常稀释____倍，需单独配制，常用EDTA螯合铁）、有机物母液（通常稀释____倍）以及植物生长调节剂母液（单独配制，浓度和稀释倍数依种类而定）。

*配制方法：按配方准确称量各成分，依次溶解于蒸馏水中。注意有些成分之间可能发生沉淀反应，应分别溶解后再混合。植物生长调节剂需根据其溶解性选择合适的溶剂：脂溶性的（如6-BA、KT、NAA）先用少量乙醇或稀酸溶解，生长素类（如2,4-D）可用少量稀碱溶解，然后再用蒸馏水定容。

*保存：母液应储存在棕色试剂瓶中，贴上标签，注明名称、浓度、配制日期。一般于2-4℃冰箱中保存。使用前需检查是否有沉淀或变质，若有则需重新配制。

2.2培养基的配制步骤

1.计算与移取：根据所需培养基的体积和各母液的稀释倍数，准确计算并移取各种母液。

2.加入蔗糖和其他成分：称取所需量的蔗糖，加入到已混合好的母液中，搅拌溶解。如需添加琼脂、活性炭、水解酪蛋白等，在此步骤加入（琼脂需加热溶解）。

3.定容：用蒸馏水将混合液定容至所需体积。

4.调整pH值：用1mol/LHCl或1mol/LNaOH调整培养基的pH值，通常为5.6-6.0（因植物种类和培养阶段而异），用pH计测定。

5.分装：将配制好的培养基趁热分装到培养容器中，分装量约为容器体积的1/4至1/3。

6.封口：分装后立即用封口膜或棉塞（需