高效液相色谱法1-2.pptxVIP

高效液相色谱法;第一节、概述;二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较;2.HPLC与GC的比较;第二节HPLC仪器;高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压

输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置

进样系统：进样器，进样阀

分离系统：色谱柱，恒温箱

检测系统：检测器

记录系统：记录装置、色谱工作站;1、贮液器和吸滤器：;2、高压输液泵;活塞型往复泵

——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵;离线超声波振荡脱气

在线惰性气体鼓泡吹扫脱气

在线真空脱气装置;4、梯度洗脱装置：;高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器;低压梯度：只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。;二、进样系统;六通阀进样;三、色谱柱;四、检测系统;石英窗;2、荧光检测器;光源;检测器;五、数据处理和计算机控制系统;第三节HPLC方法及原理;固定相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。;凝胶过滤色谱：以水或缓冲液作流动相

主要适合于水溶性高分子(蛋白、多糖等)的分离

凝胶渗透色谱：以有机溶剂作流动相

主要适合于有机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)的分离;原理：被分离组分与固定相之间发生离子交换的能

力的差别;三、亲和色谱法（AC）;第四节反相色谱法;与HIC原理类似。

固定相的极性比流动相弱，由于RPLC固相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。

;疏水层析

配体密度小，疏水力较小，对蛋白质及其复合物产生温和的吸附作用，容易解析，较好保持结构和活性。

反相层析

配体密度大，疏水力较强，对蛋白质及其复合物产生强的吸附作用，不容易解析，用有机溶剂洗脱，易引起大分子变性。;基质：疏水色谱填料是由化学性质稳定,机械强度好的树脂、硅胶；

配体：疏水配体苯基、辛基、烷基(如C4、C6、C8、C18等)组成。;反相层析分离步骤;;;;RPLC在20世纪50年代就已用于许多有机小分子的分离和分析。

80年代后，反相???相色谱(RPLC)由于其特有的优点，因此在多肽的分离纯化和制备中备受青睐,因此,RPLC是目前分离纯化和制备多肽的主要手段。;（1）固定相：

①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力；

②改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。;（2）流动相：

低粘度的流动相——增大组分在溶剂中的扩散系数Dm——减少传质阻力

（3）流速：

减小流速有利提高柱效

常采用比最佳流速高数倍的流速——加快分析速度;（4）柱温：

提高柱温——降低流动相粘度——减少传质阻力——分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，

一般在室温下进行;第六节HPLC分析方法的建立与应用;

;2、选择合适的分析方法

适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）

流动相

检测器

样品预处理;3.分析条件的优化;4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。;二、HPLC定性定量分析方法;2、定量分析;1、在食品分析中的应用

食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；

食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；

食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。

2、在环境分析中的应用

多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。;3、在生命科学中的应用

分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具

低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定

高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定;4、在医学检验中的应用

体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：

合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等

天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等

5、在无机分析中的应用

阳、阴离子的分析等。;我国药典收载HPLC法项目和数量比较表;阿维菌素对日本沼虾的毒性作用及其药物代谢动力学的研究;阿维菌素（Avermectins）是由日本北里大学大村智和美国Merck公司等首先研发的从链霉菌中灰色链霉菌发酵产生的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物。AVMs广泛应用于农业、畜牧业和水产业病害防治，具有良好的预防和治疗效果.

阿维菌素的毒性作用常引起同池养殖的日本沼虾中毒死亡事件，为了掌握日本沼虾对阿维菌素耐药程度，减少阿维菌素对日本沼虾毒害作用，进行了阿维菌素对日本沼虾毒性影响的研究。;测定阿维菌素对日本沼虾