肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室.docxVIP

南方医科大学

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生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

FORMTEXTFolin-酚试剂法测定蛋白质含量

实验日期

实验地点

合作者

指导老师

评分

教师签名

批改日期

格式要求：正文请统一用:小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的

1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；?

2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法；

3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式；

4、正确掌握使用离心机的方法步骤;

5、熟练运用溶液混匀的各种方法；

6、正确掌握溶液转移的操作；

7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤

二、实验原理

实验1肝糖原的提取与鉴定

糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中,采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出.低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中.糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外,糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。

CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu（OH）2↓

2Cu（OH）2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O

2CuOH=H20+Cu2O↓（红色）

Cu（OH)2====H2O+CuO↓（黑色）

实验2肝糖原定量测定

糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原.糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5—羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。

三、材料与方法：以流程图示意

1、实验材料

（1）肝糖原的提取与鉴定

样品：1.50g的鸡肝

试剂：5%三氯醋酸溶液、95％乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂

仪器和器材：离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温—100℃恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板

（2）肝糖原的定量测定

样品：0.15g的鸡肝

试剂：30％KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2％蒽酮溶液显色剂

仪器和器材:室温-100℃恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪

3、实验步骤与方法

（1)肝糖原的提取与鉴定：

鸡肝约1.5g,剪碎

鸡肝约1.5g,剪碎

+1ml5％三氯醋酸，研磨至乳状

+3ml5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆

+3ml5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心5min(4000r/min)

上清液(取2ml)沉淀（弃去）加碘试剂2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴糖原水解液糖原水解液2滴呈色对比

上清液(取2ml)

沉淀（弃去）

加碘试剂2滴

加碘试剂2滴

糖原溶液2滴

糖原水解液

糖原水解液2滴

呈色对比

+班氏试剂4滴

+浓HCl5滴

沸水浴15min,冷却

+50％NaOH5滴

+2

+2ml95％乙醇，混匀，静置10min

离心

离心5min(4000r/min)

沉淀上清液(弃去）

沉淀

上清液(弃去）

沸水浴

沸水浴2min，溶解沉淀

糖原溶液1ml白瓷板孔穴中

糖原溶液1ml

白瓷板孔穴中

+50%NaOH5滴沸水浴15min，冷却+浓HCl5滴+班氏试剂4滴糖原水解液

+50%NaOH5滴

沸水浴15min，冷却

+浓HCl5滴

+班氏试剂4滴

糖原水解液2滴

糖原水解液

混匀

加碘试剂2滴

加碘试剂2滴

蒸馏水2滴

加碘试剂2滴

糖原溶液2滴

呈色对比

呈色对比

沸水浴

沸水浴2min,观察变化

图一：肝糖原的提取与鉴定实验流程

（2）肝糖原定量测定

冷却，全部转入100ml容量瓶中沸水浴

冷却，全部转入100ml容量瓶中

沸