Tuo克隆：快速高效克隆PCR产物平末端DN段方法.pdfVIP

Turbo克隆：一种快速高效的将PCR产物和其

他平末端片段克隆到质粒中的方法

A.ChristopherBoyd

MRC人类遗传学单位，西部综合医院，CreweRoad，爱丁堡EH42XU，英国

收稿日期：；修订和接受日期：

该方法使用了一种新型的质粒载体p9lox5，其中包含来自噬菌体P1的lox/Cre

重组酶系统的位点特异性重组序列lox。该过程分为两个阶段。首先，在大分子

拥挤条件下（15%聚乙二醇6000）将载体和片段进行分子间连接，这可以

加速平末端连接千倍。其次，通过Cre重组酶在直接重复的载体分子内的成对

lox位点上作用，从连接产物中高效地切出环状重组分子。重组子通过常规转化

或电穿孔引入细胞。在模型系统和PCR产物克隆中，产量接近于粘性末端克隆可

获得的水平。讨论了该技术在c生成和从材料中恢复中的应用。

引言

平末端片段的连接效率远低于黏性末端片段在正常反应条件下的连接效率。

此类片段（例如通过c合成或PCR扩增产生的片段）的定量克隆需要复杂且耗

时的技术。使用传统方法促进反应需要长时间孵育和高浓度的连接酶和（1）。

替代方法涉及在片段末端添加接头，使其变为黏性末端，从而易于克隆（2）。

大约十年前就已经知道，在高浓度的各种惰性聚合物存在下诱导的高分子拥挤条件下，连接效率，特

别是平末端的连接效率，可以显著提高（3‑5）。然而，所有这些连接都是分子间的，因此这些条件

不能直接用于质粒重组子的构建。已经有一种技术被描述过（6），该技术中，通过在style

id=115%/style聚乙二醇（PEG）中进行连接生成的串联体被唯一的载体限制酶切割，然后在无

PEG的条件下进行连接，以产生所需的环状分子。

Turbocloning:afast,efficientmethodforcloning

PCRproductsandotherblunt-endedfragments

intosmids

A.ChristopherBoyd

MRCHumanGeneticsUnit,WesternGeneralHospital,CreweRoad,EdinburghEH42XU,

UK

ReceivedDecember24,1992;RevisedandAcceptedJanuary25,1993

Themethodusesanovelsmidvector,p9lox5,containingasite-specific

recombinationsequenceloxfromthelox/CrerecombinasesystemofbacteriophageP1.

Therearetwodistinctstages.Firstly,vectorandfragmentsarelied

intermolecularlyunderconditionsofmacromolecularcrowding(15%polyethylene

glycol6000)whichaccelerateblunt-endjoiningathousandfold.Secondly,circular

recombinantmolecuareefficientlyexcisedfromtheliionproductsbyCre

recombinaseactingonpairsofloxsiteswithindirectlyrepeatedvectormolecu

flankinginsert.Recombinantsareintroducedintocellsconventionallyby

transformationorelectroporation.InbothamodelsystemandthecloningofPCR

products,yieldsapproachingt