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蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

一、实验内容

将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离

心取上清液作为蛋白质粗提液

用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；

将粗提液通过SephadexG-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到

不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；

将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组

分中蛋白质的成分，分析分离效果。

二、实验过程：

1.蛋白质粗提液制备

溶液配制：0.1mol/LpH7.4磷酸缓冲液

（1）1000ml0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容

至1L；

（2）250mL

2.蛋白质浓度测定

（1）溶液配制

1mg/mL牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；

考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml90%的乙

醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，

避光保存。

（2）0~100ug/mL标准曲线测定：

取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL

蛋白质浓度020406080100

µg/ml

1mg/mLBSA溶04080120160200

液（µl）

蒸馏水（µl）200019601920188018401800

总体积（µl）200020002000200020002000

测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL

考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。

以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线

Y=aX+b，R=？。

（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液

500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL

蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均

值计算其浓度。

3、SephadexG-25凝胶层析柱进行分离

（1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，

加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为

止。

（2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶

连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。

1

（3）平衡：用10倍于柱床体积的0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的

离子环境和样品中的一致。

（4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液（留过

20uL供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来

（5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L

pH7.4的磷酸缓冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出

物，第一管收集1mL，以后每管收集200uL，共收集6管。

（6）稀释20倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个OD595值，计算各

组分的蛋白浓度。

4.SDS—PAGE

溶液配制：

100ml30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml

蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）；

100mL1.5MTris-HCl三（羟甲基）氨基甲烷，pH8.8：18.15gTris碱溶于60mL

蒸馏水中，用HCl调pH至8.8，定容至100ml蒸馏水中；

100ml0.5MTris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl

调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水