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评价荧光定量PCR仪，用这些指标

荧光定量PCR的检测是一系列从采样、保存运输、样品处理、核

酸提取、扩增等一系列流程的组合，任何一个环节出现问题都会导致

最终结果的错误。虽然在前面一系列的文章中讲述了提取试剂、扩增

试剂的评价但是这些仍远远不够，因此我在后续的文章中会尽可能覆

盖到所有的检测环节。

荧光定量PCR的检测离不开荧光定量PCR试剂和荧光定量PCR

仪器。试剂的评价可以参考（诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更

正））。但是每次提到荧光定量PCR仪的评价，大家总是望而却步。

一方面原因是荧光定量PCR仪涉及很多温度、光电信号需要专业

的设备来评估，另一方面也确实不知道从哪里入手。今天我们梳理下

在核酸检测实验室中如何通过试验来评价荧光定量PCR仪。

荧光定量PCR仪的物理性能试验相关指标

通过物理方法测定PCR性能的试验。主要包括测定温度和荧光来

进行评价，由于需要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行

相关指标的测定。

1.最大升温速率：50℃-90℃应不小于2.5℃/秒。

2.

3.平均升温速率：50℃-90℃应不小于1.5℃/秒。

4.最大降温速率：90℃-50℃应不小于2.0℃/秒。

5.平均降温速率：90℃-50℃应不小于1.5℃/秒。

6.模块控温精度：应不大于0.5℃。

7.温度准确度：测定值与设定值应不超过±0.5℃。

8.模块温度均匀性：温度差值在±1℃范围内。

9.温度持续时间准确度：温度持续时间与设定温度时间偏差在±5%

以内。

10.热盖温度偏差：温度差值在±3℃范围内。

11.荧光强度检测重复性：高中低浓度校准染料重复测定的变异

系数不大于3%。

12.荧光强度检测精密度随机选取10个及以上个检测孔，用高

中低浓度校准染料进行检测，变异系数不大于5%。

13.不同通道荧光干扰其他通道荧光检测强度不高于目标通道荧

光阈值。

14.

荧光定量PCR仪的生物化学试验相关指标

对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。该指标可以

通过荧光定量PCR的试验对仪器进行评价，每个核酸检测实验室都可

以开展的评价试验。

1.样本检测重复性对高中低浓度核酸样品进行检测，Ct值变异系

数不大于3%。

2.

3.样本线性对系列稀释梯度浓度的样品（至少5个梯度）进行检

测，回归系数R不低于0.99。

4.

5.荧光线性对系列稀释荧光染料（至少5个梯度）进行检测，回

归系数R不低于0.99。

荧光定量PCR仪评价的试验设计

1.试验准备

1.1有证标准物质

国内外有证标准物质，标准物质类型为质粒DNA或RNA。不推

荐使用自制没有进行定量的质控品。

1.2荧光染料

可以选用试剂盒自带的ROX染料或购买标准荧光染料。

1.3.荧光定量PCR方法

需要使用经过验证过的荧光定量方法：扩增效率90%-110%（越

接近100%越好）；R2大于0.99；最低检测限应低于10copies/反

应。

1.4.反应体系

质量高口碑好的反应体系。

1.5.耗材

仪器推荐使用的专用于荧光定量PCR的耗材。

1.6.荧光定量PCR反应条件

常规荧光定量PCR反应条件，普通模式，40个循环。不建议使用

快速模式和预扩增反应条件。

2.重复性试验

选择高中低浓度标准物质进行检测（推荐浓度为5000copies/反

应、500copies/反应和50copies/反应），每个浓度至少5次重复，

样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置。Ct值变异系数不大

于3%。

样品放置的位置尽可能分散，也可以如下图。

3.样本线性试验

对已知浓度的样品进行5倍