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单核细胞增生李斯特氏菌胶体金免疫层析方法的构建与效能评估

一、引言

1.1研究背景

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）是一种重要的食源性致病菌，在自然界分布广泛，能在土壤、水、植物、动物饲料以及人类和动物的粪便中找到。它对各种环境，如低温、高盐、低pH、氧化应激等，都有很强的耐受性，尤其能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖，故而被称为“冰箱杀手”。

单核细胞增生李斯特氏菌对人类健康危害极大。老人、孕妇、新生儿、免疫低下人群是其易感人群。孕妇感染后，细菌可通过胎盘感染胎儿，可能造成流产、死胎或早产、败血病和初生婴儿脑膜炎等严重后果，新生儿感染病死率高达30%-70%。健康成年人感染一般症状类似感冒，包括发热、头痛、肌肉痛、恶心、呕吐、腹泻等，但也可能发展为严重的败血症和脑膜炎。

在经济层面，李斯特菌感染造成的损失不容小觑。感染患者往往需要住院治疗和长期护理，医疗费用高昂，在美国，感染的平均医疗费用约为18,000美元，重症患者可能高达100,000美元以上。患者因感染无法工作或上学，导致生产力损失，据估计，美国每年因此造成的生产力损失高达2亿美元。此外，李斯特菌感染疫情还可能导致食品召回，对食品行业造成经济损失，如2011年美国发生的李斯特菌污染事件，造成了数亿美元的经济损失，还引发了公众对食品安全的信任危机。

传统检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，如国标法，需经过增菌、选择性分离平板分离培养、初筛试验、鉴定等步骤，整个过程至少需要4-7天，不仅耗时长，程序繁琐，试剂和人力成本也较高。在食品生产和流通速度日益加快的今天，传统检测方法难以满足快速筛查和实时监控的需求，因此，建立快速、准确、简便的检测方法迫在眉睫。

1.2国内外研究现状

国内外对于单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的研究不断深入，已发展出多种检测技术。传统检测方法以分离培养为主，我国现行国标GB4789.30-2016，虽经过多次修订，通过增加API鉴定试验代替生化试验和协同溶血试验，以及联合使用显色培养基和ATB生化鉴定仪，简化了鉴定步骤，缩短了检测周期，但整个流程仍较为繁琐，耗时久。

免疫学检测技术中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是常用方法之一，国标也曾将其列为可选检测方法。其利用抗原-抗体反应，将抗原或抗体结合到固相载体表面，再与酶交联成酶结合物，通过催化底物产生有色物质来判断结果。但ELISA存在操作步骤多、检测时间长、单克隆抗体制备困难等问题。

分子检测技术发展迅速，如聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术，具有灵敏度高、特异性强的特点。实时荧光定量PCR可精确定量、反应迅速、信号重复性好，还能避免扩增产物对环境造成的污染问题。然而，分子检测技术对实验条件和设备要求较高，操作复杂，且易产生假阴性和假阳性结果。

胶体金免疫层析技术作为一种快速检测方法，近年来受到广泛关注。它以胶体金为显色媒介，利用抗原抗体特异性结合原理，在层析过程中完成检测反应。该技术主要由样品垫、金垫（微孔）、硝酸纤维素膜（NC膜）以及吸水垫组成，这些部件相互衔接并粘贴在PVC底板上形成试纸条结构。检测时，将待检样品加入试纸条加样孔，样品通过毛细作用在试纸条上发生层析反应，一般几分钟至十几分钟内即可获得检测结果。胶体金免疫层析技术操作简单，无需复杂仪器设备和繁琐样品前处理，成本低廉，结果直观，还具有高灵敏度和强特异性，且胶体金具有良好的生物相容性和稳定性，对人体和环境无害。目前，该技术已在毒品检测、传染病检测、妊娠检测等领域广泛应用，但在单核细胞增生李斯特氏菌检测方面，虽有一定研究，但仍存在灵敏度和特异性有待进一步提高、检测范围有限等问题，需要深入研究和优化。

1.3研究目的与意义

本研究旨在建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌的胶体金免疫层析方法，通过优化抗体的制备和标记、试纸条的组装及检测条件等关键环节，提高检测的灵敏度、特异性和稳定性。

该方法的建立对食品安全检测和公共卫生具有重要意义。在食品安全检测方面，能实现对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛查，有效缩短检测时间，提高检测效率，及时发现受污染食品，防止其流入市场，保障消费者的饮食安全，维护食品行业的正常秩序。在公共卫生领域，可用于环境监测、疫情防控等工作，快速确定传染源和传播途径，为采取有效的防控措施提供依据，降低李斯特菌感染的发生率，保护易感人群的健康，减轻社会的医疗负担和经济损失。

二、单核细胞增生李斯特氏菌胶体金免疫层析方法原理

2.1胶体金的特性及制备原理

胶体金，又称金溶胶，是指分散相粒子直径在1-150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈现桔红色到紫红色。其独特的理化性质使其在免疫检测领域具有