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一、基因工程

（一）核心概念与工具

1.基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。其原理是基因重组，操作水平是DNA分子水平。

2.限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

3.DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。常用的种类有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，后者还可连接平末端。

4.基因进入受体细胞的载体常用的有质粒、噬菌体和动植物病毒等。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。

5.作为基因工程的载体，需具备的条件有：能在受体细胞中自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接；具有标记基因，便于筛选。

（二）基本操作程序

6.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。

7.获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成（适用于基因较小且序列已知的情况）。

8.PCR技术全称是多聚酶链式反应，其原理是DNA双链复制，需要的条件有：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR过程包括变性、复性和延伸三个阶段，该过程需要在PCR扩增仪中进行。

9.基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。

10.将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法（最常用，适用于双子叶植物和裸子植物）、基因枪法和花粉管通道法。导入动物细胞常用显微注射法，受体细胞多为受精卵。导入微生物细胞常用感受态细胞法，常用的微生物是大肠杆菌。

11.目的基因的检测与鉴定：首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，常用的方法是DNA分子杂交技术；其次检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是分子杂交技术；最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是抗原-抗体杂交技术。有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如抗虫或抗病的接种实验。

二、细胞工程

（一）植物细胞工程

12.植物细胞工程的基本技术包括植物组织培养和植物体细胞杂交。

13.植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。其过程可以简要概括为：离体的植物器官、组织或细胞（又称外植体）→脱分化→愈伤组织→再分化→根、芽→植物体。

14.愈伤组织的特点是：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

15.植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。其关键步骤包括用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得原生质体；再用物理（如离心、振动、电激）或化学（如聚乙二醇，简称PEG）方法诱导原生质体融合。

16.植物体细胞杂交的意义是克服了远缘杂交不亲和的障碍。

（二）动物细胞工程

17.动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养是其他动物细胞工程技术的基础。

18.动物细胞培养的过程：取动物组织块→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，称为传代培养。

19.动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境（通常在培养液中添加一定量的抗生素，并定期更换培养液）；营养（合成培养基中需加入血清、血浆等天然成分）；适宜的温度和pH；气体环境（主要有O?和CO?，后者的作用是维持培养液的pH）。

20.动物细胞核移植技术分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。目前成功率较高的是胚胎细胞核移植。

21.体细胞核移植的大致过程：将供体细胞（体细胞）的细胞核移入去核的卵母细胞中，使其重组并发育成新的胚胎，最终发育为动物个体。该技术的原理是动物细胞核的全能性。

22.动物细胞融合也称细胞杂交，原理是细胞膜的流动性。诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合类似，此外还可以用灭活的病毒诱导。

23.单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的。杂交瘤细胞是由已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的，具有既能无限增殖，又能产生专一抗体的特点。

24.制备单克隆抗体的过程中，需要进行两次筛选：第一次筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞。

25.单克隆抗体的优点有：特异性强、灵敏度高、可大量制备。其主要应用有：作为诊断试剂（最广泛）、用于治疗疾病和运载药物（如“生物导弹”）。

三、胚胎工程

（一）胚胎工程的理论基础

26.胚胎工