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融合标签技术在β-甘露聚糖酶表达与纯化中的应用及机制研究

一、引言

1.1β-甘露聚糖酶的概述

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC3.2.1.78）作为一种半纤维素水解酶，以内切方式作用于β-1,4-甘露糖苷键，能够将甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等底物降解为低聚糖和单糖。这种酶广泛存在于植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物中，然而哺乳动物体内却缺乏该酶。在植物细胞壁中，甘露聚糖是除纤维素、木聚糖之外分布最为广泛且含量较高的一类半纤维素，在许多植物中大量积累，如玉米、小麦、菜籽粕及麦麸中含量占非淀粉多糖比例分别达12%、11%、20%和34%，特别是β-半乳甘露聚糖和β-葡甘露聚糖是所有豆科植物细胞壁的重要组成成分，在豆粕中含量最高可达15-18g/kg。

在饲料领域，由于畜禽和鱼类自身的消化酶系中不含甘露聚糖酶，无法有效消化这类多糖，导致甘露聚糖类物质成为主要的抗营养因子。在饲料中添加β-甘露聚糖酶，能够水解β-1,4糖苷键，释放出与甘露聚糖结合的养分和微量元素，促进营养物质的消化与吸收，降低肠道粘度，预防动物腹泻，进而促进畜禽生长，减少养殖污染。研究表明，在以玉米/豆粕为主的低能日粮中添加0.5kg/t的β-甘露聚糖酶和美酵素，可达到与高能日粮中添加金霉素相当的增重效果和饲料报酬，在含22.8%豆粕日粮中添加β-甘露聚糖酶后，能量消化率提高了3.13%，粗蛋白消化率提高了2.57%，粗纤维消化率提高了6.45%，消化能提高了106kcal/kg以上。

在食品行业，β-甘露聚糖酶能够水解甘露聚糖等生成甘露低聚糖。甘露低聚糖作为双歧杆菌的增殖因子，可使体内有益菌自然增殖，改善肠道菌群结构，调节肠道消化系统功能，具有保肝、抗肿瘤、增强免疫力、加强肠道蠕动、降低胆固醇、抗衰老等生理活性，适用于各种肠道疾病，同时也适合老年人和儿童的日常保健。甘露低聚糖还具有优良的甜味品质，可替代蔗糖用于饮料、糖果、饼干、果脯和乳制品等食品中，是一种良好的食品添加剂，在国外已广泛应用于保健品中。魔芋胶经β-甘露聚糖酶作用后形成的低聚糖，能有效改善肠道内菌群结构，其性能及效果优于大豆低聚糖及半乳糖基转移低聚糖，且对防治高血脂症、预防动脉硬化和冠心病的发生有一定作用。

此外，在生物医药领域，β-甘露聚糖酶具备促愈合、促消化、抗菌等功效，可用于制造伤口敷料、抗癌药物以及改善肠道菌群药物；在造纸、纺织等领域也有潜在的应用价值，如在造纸过程中有助于纤维的分离和改性，在纺织中可用于改善织物的性能等。

1.2融合标签技术的发展

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术。其主要过程是利用重组DNA技术，在靶蛋白编码基因的3端或5端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质。表达的重组蛋白质可以通过其融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合，从而使重组蛋白质得以纯化。

融合标签技术的发展最初是为了使重组蛋白质的纯化更加简便。早在1958年，Courtios第一次报道了能产生β-甘露聚糖酶的真菌，此后随着研究的深入，各种融合标签系统不断被开发出来。早期常用的融合标签如多聚组氨酸标记（His-tag），由六个组氨酸残基组成，分子量仅约0.84KD，几乎不会对目标蛋白的功能造成干扰。无论是在非离子型表面活性剂存在的温和条件下，还是在用于处理包涵体蛋白的变性环境中，His标签融合蛋白都能利用固定化金属螯合层析（IMAC）进行纯化。1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S-转移酶（GST）的多肽的一步纯化，来自日本血吸虫的26-kDa的GST被克隆在大肠杆菌表达载体中，融合蛋白可从未经处理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽亲和层析加以纯化，GST标签不仅具有高度的可溶性，能提升外源蛋白在大肠杆菌中的溶解能力，还能大量表达，提高目的蛋白的表达量。

随着时间的推移，融合标签的功能日渐多样化。除了用于蛋白质的纯化，还可用于目的蛋白质的检测、定向固定，体内生物事件的可视化，提高重组蛋白质的产量，增强重组蛋白质的可溶性及稳定性。例如，FLAG标签由8个氨基酸（DYKDDDDK）组成，通常不会与目的蛋白发生相互作用，也不影响目的蛋白的功能与性质，融合FLAG的目的蛋白可直接通过FLAG进行亲和层析，这种非变性纯化方式能有效纯化有活性的融合蛋白，且纯化效率极高，还能被抗FLAG的抗体精准识别，便于通过WesternBlot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测与鉴定，融合在N端的FLAG可被肠激酶切除（DDDK），