基因打靶技术原理及应用实例分析.pdfVIP

达标第43讲

1．打靶技术是建立在同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来

的一种分子生物学技术。结合图示回答问题。

(注：neor是新霉素抗性；tk的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，

导致细胞。)

(1)将目的和与细胞内靶同源的片段都重组到__载体(或质粒)__上，构建

打靶载体(表达载体)。

(2)打靶载体验证正确后，利用__限制__酶将之线性化，以提高重组率。通过__显

微注射__技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶同源的区段就有几率发生同源

重组。

(3)为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入__新霉素和丙氧鸟苷__。最后还

需要通过__分子杂交__技术鉴定同源重组的细胞(去除靶)，将这样的细胞通过__

动物细胞(或克隆)__培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮或

冷冻保存。

(4)将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、__生理状态相同(或经同期)__

的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠

长大后，体内同时存在被“修饰”过的和未被“修饰”的。如果某些小鼠的__生殖

细胞__(填“体细胞”或“生殖细胞”)恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能

出现完全被“修饰”过的小鼠。

解析(1)构建打靶载体(表达载体)，需要将目的和与细胞内靶同源的

片段都重组到载体(或质粒)上。(2)将环状的打靶载体线性化，需利用限制酶进行切割，通过

显微注射技术将其导入胚胎干细胞。(3)在同源重组时，tk将被切除而丢失，但新霉素

抗性得以保留且结构完整，所以为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉

素和丙氧鸟苷。鉴定去除靶的同源重组细胞，可通过分子杂交技术。将这样的细

胞通过动物细胞培养后，获得大量打靶成功的细胞。(4)胚胎移植时，需将含有打靶成功细

胞的囊胚移植到同种、生理状态相同(或经同期)的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进

行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。生殖细胞参与新的形成过程，如果某些小鼠的生殖

细胞恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现完全被“修饰”过的小鼠。

2．家蚕细胞具有高效表达外源的能力。将人干扰素导入家蚕细胞并大规模培

养，可提取干扰素用于制药。

(1)进行操作前，需用__胰蛋白(或胶原蛋白)__酶短时处理幼蚕组织，以便获得单

个细胞。

(2)为使干扰素在家蚕细胞中高效表达，需要把来自c的干扰素片段

正确表达载体的__启动子__和__终止子__之间。

(3)采用PCR技术可验证干扰素是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成

分应该包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核苷酸、模板、__Taq酶(或热稳定

性聚合酶)__和__引物__。

(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的

中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以__增大细胞贴壁生长的附着面积__，增加培养的

细胞数量，也有利于空气交换。

解析(1)为了使组织分散为单个细胞通常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。(2)表达

载体包括启动子、终止子、目的和标记。启动子位于目的的首端，终止子位于

目的的尾端。(3)PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种

脱氧核苷酸、模板